【摘要】：丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染而引起的嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病。全球約有1.3-1.7億HCV感染者,大約20%可以自然清除,80%發(fā)展為HCV慢性感染。10-20%的HCV慢性感染會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為慢性進(jìn)行性肝病,包括肝硬化、肝細(xì)胞癌等。 HCV是一種非甲非乙型肝炎病毒,后命名為丙型肝炎病毒,歸屬于肝炎病毒屬(Hepacivirus),黃病毒科(Flaviviridae)。HCV病毒體呈球形,為單股正鏈RNA病毒。HCV-RNA全長約為9.6kb,包括一個(gè)位于基因中央的開放閱讀框(ORF)。該閱讀框編碼3000多氨基酸的前體多聚蛋白,其通過宿主和病毒的蛋白酶作用被切割成10個(gè)具有獨(dú)立功能的HCV蛋白,根據(jù)功能的不同分別命名為核心蛋白Core (C),包膜蛋白(envelope protein)1、2(E1、E2), p7和非結(jié)構(gòu)蛋白(non structural protein) NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。 NS3蛋白是HCV病毒復(fù)制中重要的功能蛋白之一,發(fā)揮絲氨酸蛋白酶,解旋酶和NTP酶活性,成為當(dāng)今HCV診斷,治療和預(yù)防的研究熱點(diǎn)。NS3蛋白N末端1/3具有絲氨酸蛋白酶活性,與NS4A構(gòu)成復(fù)合體,對(duì)多聚蛋白前體起到剪切作用。C末端2/3氨基酸構(gòu)成HCV NS3解旋酶(helicase),發(fā)揮三磷酸腺苷酶(ATPase)和解旋酶作用,使雙鏈RNA解旋,對(duì)HCVRNA復(fù)制起到重要作用。此外,研究表明,NS3解旋酶含有大量B細(xì)胞優(yōu)勢表位,能在HCV感染早期誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生體液免疫反應(yīng),產(chǎn)生抗體。因此NS3蛋白(1192～1457aa)常用作HCV抗體EIA檢測試劑盒中的包被蛋白。 近年來,由于NS3蛋白功能的進(jìn)一步明確,發(fā)現(xiàn)NS3解旋酶區(qū)域中包含大量的高度保守的功能區(qū),例如,模序I (Walker A:207GSGKS211)是ATP結(jié)合位點(diǎn),在ATP水解中發(fā)揮作用。因此,NS3解旋酶成為抗HCV病毒復(fù)制的理想靶位。研究者致力于抑制劑與NS3解旋酶的相互作用,來研發(fā)新一代NS3解旋酶抑制劑。在本課題中,制備了大量抗HCVNS3解旋酶的單克隆抗體(單抗),研究單抗識(shí)別表位位點(diǎn)及意義,并進(jìn)一步研究單抗對(duì)HCVNS3功能的影響,探索表位氨基酸位點(diǎn)和單抗在HCV診斷與治療中的潛在價(jià)值。 我們從含有HCVNS3(lb型)全長基因的質(zhì)粒pMD20NS2-4A中,擴(kuò)增NS3目的基因,并構(gòu)建表達(dá)載體pET-32a-NS3,采用基因原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行目的基因表達(dá)�？扇苄缘鞍淄ㄟ^Ni-NTA親和層析純化,獲得純度約為90%的截短型NS3蛋白(1192-1459aa) T-rNS3。以T-rNS3蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠,采用鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交技術(shù)制備抗HCVNS3單克隆抗體。此外,我們獲得了三種NS3全長蛋白：一種是從轉(zhuǎn)染pTY-CMV-NS3質(zhì)粒并穩(wěn)定表達(dá)HCV NS3蛋白的293T細(xì)胞中獲得重組NS3蛋白(FL-rNS3);一種是從轉(zhuǎn)染HCV2a型RNA(JFH-1)的Huh7.5.1細(xì)胞中獲得的天然NS3蛋白；還有一種為純度為95%的商品化蛋白FL4b-rNS3,用來進(jìn)行解旋酶體外功能實(shí)驗(yàn)。為確定B細(xì)胞表位,設(shè)計(jì)并合成了47條多肽。其中,29條為重疊7個(gè)氨基酸的長度為16個(gè)氨基酸長肽,12條為根據(jù)長肽P05、P21設(shè)計(jì)的短肽,5條為根據(jù)P05、P21與其他亞型HCV. GB病毒C比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)的突變肽,一條布魯士桿菌16肽作為陰性對(duì)照。用合成肽通過peptide-ELISA和競爭抑制ELISA方法與單克隆抗體反應(yīng),對(duì)抗體識(shí)別表位進(jìn)行確定。通過ELISA、Western-Blot和免疫熒光染色(IFS)等方法,用T-rNS3蛋白,FL-rNS3蛋白,天然NS3蛋白,FL4b-rNS3蛋白對(duì)單克隆抗體進(jìn)行鑒定并對(duì)抗體識(shí)別表位進(jìn)行分類。為確定線性表位的保守性,我們從GenBank數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)選取了大量HCV不同亞型和黃病毒科其他病毒的氨基酸序列與線性表位氨基酸進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果合成突變肽,分別與單抗進(jìn)行ELISA反應(yīng),分析線性表位的保守性和單抗的特異性。為確定線性表位的免疫優(yōu)勢性,通過peptide-ELISA方法對(duì)源于我國廣東和北京地區(qū)獻(xiàn)血者中的HCV感染者和健康獻(xiàn)血者進(jìn)行研究,測定表位多肽與血清中抗體的反應(yīng)性,與常規(guī)兩種不同血清抗體EIA試劑盒篩查和核酸檢測結(jié)果相比較,評(píng)估表位多肽ELISA檢測與常規(guī)方法檢測的符合率。根據(jù)兩種EIA方法測定抗體和PCR方法測定病毒載量的結(jié)果,將136份HCV感染樣本分為50份自然康復(fù)性(RNA-/Ab+)和86份慢性(RNA+/Ab+).以128份健康人血樣作為陰性對(duì)照,確定健康人血清抗體水平(S/CO值：mean+2SD,95%可信區(qū)間),以此評(píng)估多肽與HCV陽性樣品的反應(yīng)陽性率,繪制ROC曲線并確立最優(yōu)Cut-off值,并以此計(jì)算得到表位多肽與抗體反應(yīng)的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值(PPV)和陰性預(yù)測值(NPV)。用Kolmogorov-Smirnov Z分析ROC值與標(biāo)準(zhǔn)值(0.5)的差異。用Pearson Chi-Square檢驗(yàn)比較表位多肽分別與HCV慢性感染樣品和HCV自然康復(fù)性樣品反應(yīng)兩組之間的差異。此外,我們還通過體外HCVNS3解旋酶活性檢測實(shí)驗(yàn),評(píng)估單克隆抗體對(duì)解旋酶的抑制作用程度。用單項(xiàng)方差分析和Dunnett's T3法來比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異,P0.05即為差異顯著。 通過以上實(shí)驗(yàn)方法,用雜交瘤技術(shù)制備了29株單克隆抗體。單抗分別與多肽進(jìn)行ELISA反應(yīng),結(jié)果示,有6株單克隆抗體識(shí)別8條16個(gè)氨基酸的長肽,其中單抗1C11所識(shí)別的P13、P14可以示為一條表位氨基酸序列,而1A10所識(shí)別的P09、P16是一條不連續(xù)的線性表位序列。因此,表位篩選共獲得5條連續(xù)性的線性表位和一條非連續(xù)性的線性表位。29株單抗與重組NS3蛋白和天然NS3蛋白的Weston-blot結(jié)果顯示：27株與變性的T-rNS3反應(yīng)；8株與變性的FL-rNS3反應(yīng),其中3株與變性的天然蛋白反應(yīng)。與重組NS3蛋白和天然NS3蛋白的IFS結(jié)果顯示：10株單抗與非變性的FL-rNS3蛋白反應(yīng)；7株與非變性的天然FL-rNS3蛋白反應(yīng),其中六株(mAb2E12, mAb4B4, mAb3E5, mAb3H3, mAb5F6, mAb6G7)與FL-rNS3蛋白交叉反應(yīng),一株(mAb5C9)不反應(yīng)。通過上述結(jié)果,將29株單抗識(shí)別的HCVNS3抗原表位分為線性(6株)、構(gòu)象性(3株)、半構(gòu)象性(3株)三個(gè)類型(其余17株未分類)。識(shí)別線性表位的單抗中,單抗2E12和3E5與天然NS3蛋白結(jié)合。為精確這兩株單抗識(shí)別的表位,我們用短肽與單抗預(yù)孵育的混合物通過ELISA方法和16個(gè)氨基酸的長肽進(jìn)行競爭抑制；并用短肽包被,與單抗進(jìn)行peptide-ELISA。結(jié)果示,2E12識(shí)別的表位EP05為205PTGSGKSTK213；3E5識(shí)別的表位EP21為346EIPFYGKAIPIETIKG361,該表位其核心氨基酸序列為347IPFYGKAI354。分析兩條表位在HCVNS3蛋白中的位置,發(fā)現(xiàn)EP05所在位置覆蓋了NS3解旋酶中的ATP結(jié)合位點(diǎn)(207GSGKS211), EP21的位置接近核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。將兩條表位氨基酸與HCV其他亞型和黃病毒科其他病毒的相似位點(diǎn)的氨基酸序列進(jìn)行比較,分析線性表位的特異性與相似性。發(fā)現(xiàn)EP05氨基酸序列與不同亞型HCV和黃病毒科非人類感染病毒GB病毒B相似位點(diǎn)的氨基酸完全相同,與人感染病毒GB病毒C相近(存在K208A變異)；根據(jù)變異情況,設(shè)計(jì)突變肽GP05'(K208A),結(jié)果示單抗2E12不與GP05’反應(yīng),說明EP05在HCV各個(gè)亞型中完全保守,在人感染性的黃病毒科中高度特異。EP21與不同亞型的HCV相似序列相比較,氨基酸呈現(xiàn)高度保守性,僅在少數(shù)亞型中有I347V、K352R、I354L變異,與黃病毒科GB病毒C比較存在K352H、A353G變異；Peptide-ELISA結(jié)果示,單抗3E5不與VatP2101(I347V)、VatP2102(K352R)和GP21'(K352H和A353G)反應(yīng),與VatP2103(I354L)弱反應(yīng)。但是,在ELISA和IFS中,單抗3E5與含有1347V和K352R突變位點(diǎn)的FL-rNS3(4b型)和天然NS3蛋白(2a型)反應(yīng)陽性,說明EP21核心區(qū)域上述位點(diǎn)氨基酸的改變,可能影響表位在線性條件下與單抗的結(jié)合,但在空間狀態(tài)下,由于游離表位氨基酸的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性,即使上述位點(diǎn)氨基酸改變也不影響與單抗的反應(yīng)。單抗2E12和3E5均不與登革熱病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。進(jìn)一步證明了單克隆抗體能特異性結(jié)合HCVNS3蛋白。 為評(píng)估高度保守性表位與HCV感染性樣品中抗體反應(yīng)的潛在優(yōu)勢,通過Peptide-ELISA方法,用含有表位EP05的長肽P05和含有表位EP21的長肽P21對(duì)136份HCV感染性血液樣品(86份慢性感染：RNA+/Ab+;50份自然康復(fù)：RNA-/Ab+)和128份健康者血液樣品(RNA-/Ab-)進(jìn)行篩查。根據(jù)長肽與健康者血樣反應(yīng)結(jié)果,通過計(jì)算mean+2SD,得到Cut-Off值分別為0.267(P05)和0.298(P21)。以此計(jì)算P05和P21與慢性感染樣品反應(yīng)的陽性率分別為79.1%和59.3%,顯著高于與自然康復(fù)性樣品反應(yīng)的陽性率58%和30%(P0.001)。以P05和P21分別與214份血樣(86份慢性感染樣品和128份健康獻(xiàn)血者樣品),178份血樣(50份自然康復(fù)性樣品和128份健康獻(xiàn)血者樣品),264份全部樣品(86份慢性感染樣品、50份自然康復(fù)性樣品和128份健康獻(xiàn)血者樣品)的ELISA結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果進(jìn)行符合率比較,繪制ROC曲線。結(jié)果示,P05和P21與214份血樣反應(yīng)曲線下面積分別為0.930、0.859；P05,P21與178份自然康復(fù)性感染和健康人血清反應(yīng)的曲線下面積分別為0.843、0.782；P05,P21與264份全部血清反應(yīng)的曲線下面積分別為0.898、0.830。兩條多肽對(duì)于診斷HCV均具有顯著意義(P0.001)。P05、P21兩個(gè)表位多肽與常規(guī)法檢測結(jié)果的符合率分別為73%、88%,是HCV的兩個(gè)優(yōu)勢抗原表位。 由上述結(jié)果及分析可知,單抗2E12識(shí)別表位覆蓋了解旋酶區(qū)域I的ATP結(jié)合位點(diǎn),這樣抗體與表位的結(jié)合就有可能對(duì)解旋酶的功能造成影響。為了對(duì)此進(jìn)行研究,我們?cè)隗w外進(jìn)行解旋酶活性功能實(shí)驗(yàn)。按不同濃度將高純度4b型重組全長NS3蛋白(FL4b-rNS3)與DNA底物混合,FL4b-rNS3發(fā)揮解旋功能,將雙鏈DNA解旋為單鏈,釋放FAM熒光。儀器通過對(duì)熒光的檢測,來評(píng)估解旋酶的效率。結(jié)果示：隨著FL4b-rNS3濃度的增加,解旋效率越高。根據(jù)解旋酶活性功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將適當(dāng)濃度的mAb2E12和一株非相關(guān)抗體(作為陰性對(duì)照)分別與FL4b-rNS3預(yù)孵育后的混合物加入到DNA底物中。通過熒光檢測結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)mAb2E12可以對(duì)FL4b-rNS3解旋酶活性起到一定的抑制作用(P=0.003),使解旋活性降低大約50%,而對(duì)照抗體則不具有抑制性(P=0.239)。由此可以推測出,mAb2E12可能起到HCV解旋酶抑制劑的作用,進(jìn)而有可能影響到HCV病毒復(fù)制。但是由于FL4b-rNS3蛋白不能達(dá)到相對(duì)高的純度,使蛋白污染了少量的宿主細(xì)胞的解旋酶。這種污染會(huì)對(duì)雙鏈DNA起到一定的解旋作用,產(chǎn)生單鏈DNA,釋放熒光,干擾體外抑制試驗(yàn)結(jié)果。為了避免其他解旋酶的污染,精確驗(yàn)證mAb2E12的抑制功能,我們將在下一步的實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的解旋酶功能實(shí)驗(yàn),即把重組mAb2E12的病毒載體轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定復(fù)制HCV的Huh7.5.1細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)評(píng)估抗體對(duì)解旋酶活性的抑制以及對(duì)病毒復(fù)制的影響。 綜上所述,在本研究中,我們共制備29株抗HCV NS3的單克隆抗體。其中,mAb2E12識(shí)別HCVNS3解旋酶完全保守性表位EP05,該表位位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ中的模序I (WalkerA)的ATP結(jié)合位點(diǎn)；mAb3E5識(shí)別HCV NS3解旋酶高度保守性表位EP21,該表位接近解旋酶核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。單抗與表位的特異性結(jié)合可能會(huì)影響到HCV復(fù)制中的解旋酶活性。目前數(shù)據(jù)表明,mAb2E12和mAb3E5對(duì)HCV慢性感染診斷和抗病毒治療存在一定的生物學(xué)價(jià)值。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉麗君;魏來;;丙型肝炎病毒的流行病學(xué)[J];傳染病信息;2007年05期

2 ;丙型肝炎防治指南[J];實(shí)用肝臟病雜志;2004年03期

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本文編號(hào)：2433006