【摘要】：丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染而引起的嚴重威脅人類健康的傳染性疾病。全球約有1.3-1.7億HCV感染者,大約20%可以自然清除,80%發(fā)展為HCV慢性感染。10-20%的HCV慢性感染會進一步發(fā)展為慢性進行性肝病,包括肝硬化、肝細胞癌等。 HCV是一種非甲非乙型肝炎病毒,后命名為丙型肝炎病毒,歸屬于肝炎病毒屬(Hepacivirus),黃病毒科(Flaviviridae)。HCV病毒體呈球形,為單股正鏈RNA病毒。HCV-RNA全長約為9.6kb,包括一個位于基因中央的開放閱讀框(ORF)。該閱讀框編碼3000多氨基酸的前體多聚蛋白,其通過宿主和病毒的蛋白酶作用被切割成10個具有獨立功能的HCV蛋白,根據(jù)功能的不同分別命名為核心蛋白Core (C),包膜蛋白(envelope protein)1、2(E1、E2), p7和非結構蛋白(non structural protein) NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。 NS3蛋白是HCV病毒復制中重要的功能蛋白之一,發(fā)揮絲氨酸蛋白酶,解旋酶和NTP酶活性,成為當今HCV診斷,治療和預防的研究熱點。NS3蛋白N末端1/3具有絲氨酸蛋白酶活性,與NS4A構成復合體,對多聚蛋白前體起到剪切作用。C末端2/3氨基酸構成HCV NS3解旋酶(helicase),發(fā)揮三磷酸腺苷酶(ATPase)和解旋酶作用,使雙鏈RNA解旋,對HCVRNA復制起到重要作用。此外,研究表明,NS3解旋酶含有大量B細胞優(yōu)勢表位,能在HCV感染早期誘導機體發(fā)生體液免疫反應,產(chǎn)生抗體。因此NS3蛋白(1192～1457aa)常用作HCV抗體EIA檢測試劑盒中的包被蛋白。 近年來,由于NS3蛋白功能的進一步明確,發(fā)現(xiàn)NS3解旋酶區(qū)域中包含大量的高度保守的功能區(qū),例如,模序I (Walker A:207GSGKS211)是ATP結合位點,在ATP水解中發(fā)揮作用。因此,NS3解旋酶成為抗HCV病毒復制的理想靶位。研究者致力于抑制劑與NS3解旋酶的相互作用,來研發(fā)新一代NS3解旋酶抑制劑。在本課題中,制備了大量抗HCVNS3解旋酶的單克隆抗體(單抗),研究單抗識別表位位點及意義,并進一步研究單抗對HCVNS3功能的影響,探索表位氨基酸位點和單抗在HCV診斷與治療中的潛在價值。 我們從含有HCVNS3(lb型)全長基因的質(zhì)粒pMD20NS2-4A中,擴增NS3目的基因,并構建表達載體pET-32a-NS3,采用基因原核表達系統(tǒng)進行目的基因表達�？扇苄缘鞍淄ㄟ^Ni-NTA親和層析純化,獲得純度約為90%的截短型NS3蛋白(1192-1459aa) T-rNS3。以T-rNS3蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠,采用鼠脾細胞與骨髓瘤細胞雜交技術制備抗HCVNS3單克隆抗體。此外,我們獲得了三種NS3全長蛋白：一種是從轉(zhuǎn)染pTY-CMV-NS3質(zhì)粒并穩(wěn)定表達HCV NS3蛋白的293T細胞中獲得重組NS3蛋白(FL-rNS3);一種是從轉(zhuǎn)染HCV2a型RNA(JFH-1)的Huh7.5.1細胞中獲得的天然NS3蛋白；還有一種為純度為95%的商品化蛋白FL4b-rNS3,用來進行解旋酶體外功能實驗。為確定B細胞表位,設計并合成了47條多肽。其中,29條為重疊7個氨基酸的長度為16個氨基酸長肽,12條為根據(jù)長肽P05、P21設計的短肽,5條為根據(jù)P05、P21與其他亞型HCV. GB病毒C比對結果設計的突變肽,一條布魯士桿菌16肽作為陰性對照。用合成肽通過peptide-ELISA和競爭抑制ELISA方法與單克隆抗體反應,對抗體識別表位進行確定。通過ELISA、Western-Blot和免疫熒光染色(IFS)等方法,用T-rNS3蛋白,FL-rNS3蛋白,天然NS3蛋白,FL4b-rNS3蛋白對單克隆抗體進行鑒定并對抗體識別表位進行分類。為確定線性表位的保守性,我們從GenBank數(shù)據(jù)庫中隨機選取了大量HCV不同亞型和黃病毒科其他病毒的氨基酸序列與線性表位氨基酸進行比對。根據(jù)比對結果合成突變肽,分別與單抗進行ELISA反應,分析線性表位的保守性和單抗的特異性。為確定線性表位的免疫優(yōu)勢性,通過peptide-ELISA方法對源于我國廣東和北京地區(qū)獻血者中的HCV感染者和健康獻血者進行研究,測定表位多肽與血清中抗體的反應性,與常規(guī)兩種不同血清抗體EIA試劑盒篩查和核酸檢測結果相比較,評估表位多肽ELISA檢測與常規(guī)方法檢測的符合率。根據(jù)兩種EIA方法測定抗體和PCR方法測定病毒載量的結果,將136份HCV感染樣本分為50份自然康復性(RNA-/Ab+)和86份慢性(RNA+/Ab+).以128份健康人血樣作為陰性對照,確定健康人血清抗體水平(S/CO值：mean+2SD,95%可信區(qū)間),以此評估多肽與HCV陽性樣品的反應陽性率,繪制ROC曲線并確立最優(yōu)Cut-off值,并以此計算得到表位多肽與抗體反應的靈敏度、特異性、陽性預測值(PPV)和陰性預測值(NPV)。用Kolmogorov-Smirnov Z分析ROC值與標準值(0.5)的差異。用Pearson Chi-Square檢驗比較表位多肽分別與HCV慢性感染樣品和HCV自然康復性樣品反應兩組之間的差異。此外,我們還通過體外HCVNS3解旋酶活性檢測實驗,評估單克隆抗體對解旋酶的抑制作用程度。用單項方差分析和Dunnett's T3法來比較實驗組和對照組的差異,P0.05即為差異顯著。 通過以上實驗方法,用雜交瘤技術制備了29株單克隆抗體。單抗分別與多肽進行ELISA反應,結果示,有6株單克隆抗體識別8條16個氨基酸的長肽,其中單抗1C11所識別的P13、P14可以示為一條表位氨基酸序列,而1A10所識別的P09、P16是一條不連續(xù)的線性表位序列。因此,表位篩選共獲得5條連續(xù)性的線性表位和一條非連續(xù)性的線性表位。29株單抗與重組NS3蛋白和天然NS3蛋白的Weston-blot結果顯示：27株與變性的T-rNS3反應；8株與變性的FL-rNS3反應,其中3株與變性的天然蛋白反應。與重組NS3蛋白和天然NS3蛋白的IFS結果顯示：10株單抗與非變性的FL-rNS3蛋白反應；7株與非變性的天然FL-rNS3蛋白反應,其中六株(mAb2E12, mAb4B4, mAb3E5, mAb3H3, mAb5F6, mAb6G7)與FL-rNS3蛋白交叉反應,一株(mAb5C9)不反應。通過上述結果,將29株單抗識別的HCVNS3抗原表位分為線性(6株)、構象性(3株)、半構象性(3株)三個類型(其余17株未分類)。識別線性表位的單抗中,單抗2E12和3E5與天然NS3蛋白結合。為精確這兩株單抗識別的表位,我們用短肽與單抗預孵育的混合物通過ELISA方法和16個氨基酸的長肽進行競爭抑制；并用短肽包被,與單抗進行peptide-ELISA。結果示,2E12識別的表位EP05為205PTGSGKSTK213；3E5識別的表位EP21為346EIPFYGKAIPIETIKG361,該表位其核心氨基酸序列為347IPFYGKAI354。分析兩條表位在HCVNS3蛋白中的位置,發(fā)現(xiàn)EP05所在位置覆蓋了NS3解旋酶中的ATP結合位點(207GSGKS211), EP21的位置接近核苷酸結合位點。將兩條表位氨基酸與HCV其他亞型和黃病毒科其他病毒的相似位點的氨基酸序列進行比較,分析線性表位的特異性與相似性。發(fā)現(xiàn)EP05氨基酸序列與不同亞型HCV和黃病毒科非人類感染病毒GB病毒B相似位點的氨基酸完全相同,與人感染病毒GB病毒C相近(存在K208A變異)；根據(jù)變異情況,設計突變肽GP05'(K208A),結果示單抗2E12不與GP05’反應,說明EP05在HCV各個亞型中完全保守,在人感染性的黃病毒科中高度特異。EP21與不同亞型的HCV相似序列相比較,氨基酸呈現(xiàn)高度保守性,僅在少數(shù)亞型中有I347V、K352R、I354L變異,與黃病毒科GB病毒C比較存在K352H、A353G變異；Peptide-ELISA結果示,單抗3E5不與VatP2101(I347V)、VatP2102(K352R)和GP21'(K352H和A353G)反應,與VatP2103(I354L)弱反應。但是,在ELISA和IFS中,單抗3E5與含有1347V和K352R突變位點的FL-rNS3(4b型)和天然NS3蛋白(2a型)反應陽性,說明EP21核心區(qū)域上述位點氨基酸的改變,可能影響表位在線性條件下與單抗的結合,但在空間狀態(tài)下,由于游離表位氨基酸的結構復雜性,即使上述位點氨基酸改變也不影響與單抗的反應。單抗2E12和3E5均不與登革熱病毒發(fā)生交叉反應。進一步證明了單克隆抗體能特異性結合HCVNS3蛋白。 為評估高度保守性表位與HCV感染性樣品中抗體反應的潛在優(yōu)勢,通過Peptide-ELISA方法,用含有表位EP05的長肽P05和含有表位EP21的長肽P21對136份HCV感染性血液樣品(86份慢性感染：RNA+/Ab+;50份自然康復：RNA-/Ab+)和128份健康者血液樣品(RNA-/Ab-)進行篩查。根據(jù)長肽與健康者血樣反應結果,通過計算mean+2SD,得到Cut-Off值分別為0.267(P05)和0.298(P21)。以此計算P05和P21與慢性感染樣品反應的陽性率分別為79.1%和59.3%,顯著高于與自然康復性樣品反應的陽性率58%和30%(P0.001)。以P05和P21分別與214份血樣(86份慢性感染樣品和128份健康獻血者樣品),178份血樣(50份自然康復性樣品和128份健康獻血者樣品),264份全部樣品(86份慢性感染樣品、50份自然康復性樣品和128份健康獻血者樣品)的ELISA結果與標準檢測結果進行符合率比較,繪制ROC曲線。結果示,P05和P21與214份血樣反應曲線下面積分別為0.930、0.859；P05,P21與178份自然康復性感染和健康人血清反應的曲線下面積分別為0.843、0.782；P05,P21與264份全部血清反應的曲線下面積分別為0.898、0.830。兩條多肽對于診斷HCV均具有顯著意義(P0.001)。P05、P21兩個表位多肽與常規(guī)法檢測結果的符合率分別為73%、88%,是HCV的兩個優(yōu)勢抗原表位。 由上述結果及分析可知,單抗2E12識別表位覆蓋了解旋酶區(qū)域I的ATP結合位點,這樣抗體與表位的結合就有可能對解旋酶的功能造成影響。為了對此進行研究,我們在體外進行解旋酶活性功能實驗。按不同濃度將高純度4b型重組全長NS3蛋白(FL4b-rNS3)與DNA底物混合,FL4b-rNS3發(fā)揮解旋功能,將雙鏈DNA解旋為單鏈,釋放FAM熒光。儀器通過對熒光的檢測,來評估解旋酶的效率。結果示：隨著FL4b-rNS3濃度的增加,解旋效率越高。根據(jù)解旋酶活性功能實驗結果,將適當濃度的mAb2E12和一株非相關抗體(作為陰性對照)分別與FL4b-rNS3預孵育后的混合物加入到DNA底物中。通過熒光檢測結果,可以發(fā)現(xiàn)mAb2E12可以對FL4b-rNS3解旋酶活性起到一定的抑制作用(P=0.003),使解旋活性降低大約50%,而對照抗體則不具有抑制性(P=0.239)。由此可以推測出,mAb2E12可能起到HCV解旋酶抑制劑的作用,進而有可能影響到HCV病毒復制。但是由于FL4b-rNS3蛋白不能達到相對高的純度,使蛋白污染了少量的宿主細胞的解旋酶。這種污染會對雙鏈DNA起到一定的解旋作用,產(chǎn)生單鏈DNA,釋放熒光,干擾體外抑制試驗結果。為了避免其他解旋酶的污染,精確驗證mAb2E12的抑制功能,我們將在下一步的實驗研究中進行細胞內(nèi)的解旋酶功能實驗,即把重組mAb2E12的病毒載體轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定復制HCV的Huh7.5.1細胞內(nèi),在細胞內(nèi)評估抗體對解旋酶活性的抑制以及對病毒復制的影響。 綜上所述,在本研究中,我們共制備29株抗HCV NS3的單克隆抗體。其中,mAb2E12識別HCVNS3解旋酶完全保守性表位EP05,該表位位于結構域Ⅰ中的模序I (WalkerA)的ATP結合位點；mAb3E5識別HCV NS3解旋酶高度保守性表位EP21,該表位接近解旋酶核苷酸結合位點。單抗與表位的特異性結合可能會影響到HCV復制中的解旋酶活性。目前數(shù)據(jù)表明,mAb2E12和mAb3E5對HCV慢性感染診斷和抗病毒治療存在一定的生物學價值。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.63

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 劉麗君;魏來;;丙型肝炎病毒的流行病學[J];傳染病信息;2007年05期

2 ;丙型肝炎防治指南[J];實用肝臟病雜志;2004年03期

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本文編號：2433006