【摘要】：巨噬細胞(Macrophages,Mφ)是造血系統(tǒng)中最具可塑性的細胞,存在于所有的組織中,在細胞正常發(fā)育、體內(nèi)平衡、組織修復和對病原體的免疫反應(yīng)中扮演了許多不同的角色。結(jié)核(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的人獸共患慢性傳染病,是嚴重威脅人類健康的三大感染性疾病之一。在抗MTB感染的免疫應(yīng)答中,巨噬細胞是其主要的宿主細胞,所以研究巨噬細胞與MTB的相互作用對結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展起著非常重要的作用。目前實驗研究用人類巨噬細胞多來源于腫瘤細胞系和外周血單核細胞。腫瘤細胞系來源的巨噬細胞容易發(fā)生遺傳結(jié)構(gòu)改變,造成功能缺失,外周血來源的巨噬細胞則獲取困難且數(shù)量較少,如何獲取大量有功能活性的巨噬細胞是研究的關(guān)鍵,誘導性多能干細胞(Induced pluripotent stem cells,iPS)技術(shù)的出現(xiàn)為體外獲得大量巨噬細胞提供了新思路。iPS是通過體外導入特定的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)⒔K末分化的體細胞重編程為具有胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ES)特性的多能細胞,即能夠自我更新并可分化為3個胚層來源所有細胞的能力。iPS避免倫理道德和免疫排斥反應(yīng)等局限而備受青睞。研究已證實iPS在體外特定誘導條件下,能夠定向分化為巨噬細胞。iPS誘導分化為巨噬細胞的方法大致可以分為三類:(1)通過iPS形成類胚體(Embryonic body,EB);(2)與小鼠骨髓基質(zhì)細胞OP9,S17等共培養(yǎng);(3)在基質(zhì)膠上添加不同細胞因子直接誘導分化。目前,iPS來源巨噬細胞的研究大都集中在腫瘤免疫等方面,尚缺乏iPS來源的巨噬細胞在抗結(jié)核免疫機理方面的研究。鑒于此,本研究以人iPS(human i PS,hiPS)為靶細胞,體外誘導分化為巨噬細胞,并探討了該巨噬細胞對卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)的免疫功能。本研究首先通過堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP),反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR),免疫細胞化學(immunocytochemistry),EB分化實驗等方法對hiPS進行多能性的檢測,在此基礎(chǔ)上,通過EB形成無飼養(yǎng)層法和OP9共培養(yǎng)兩種方法誘導人i PS分化為巨噬細胞(iPS-Mφ),并對無飼養(yǎng)層法來源的iPS-Mφ進行了細胞形態(tài)學觀察、吉姆薩染色、非特異性酯酶染色(α-NAE)、吞噬功能和細胞表面特異性抗原表達檢測等一系列鑒定。最后,利用BCG感染體外培養(yǎng)iPS-Mφ,并分析BCG對iPS-Mφ一氧化氮(nitric oxide,NO)的產(chǎn)生、腫瘤壞死因子-alpha(tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達情況,同時以人單核細胞系THP-1來源的巨噬細胞(THP-1-Mφ)為對照。結(jié)果表明,hiPS經(jīng)AKP染色呈陽性,表達Oct-4和Nanog;所形成的類胚體表達內(nèi)胚層標記基因AFP,中胚層標記基因Gata-1和外胚層標記基因Nestin,表明靶細胞hiPS具有多能干細胞特性,能夠用于后續(xù)分化實驗;無飼養(yǎng)層類胚體形成的方法和以O(shè)P9為飼養(yǎng)層兩種方法得到的iPS-Mφ具有巨噬細胞所特有的形態(tài)特征(圓形、橢圓形、梭形及不規(guī)則形等,部分細胞可見偽足和凸起);進一步對iPS-Mφ進行特性和功能鑒定發(fā)現(xiàn),iPS-Mφ吉姆薩染色和非特異性酯酶染色(α-NAE)染色陽性,并具有較強的吞噬能力,同時可檢測到特異性的表面抗原白細胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)CD14、CD11b、CD40、CD68和組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)MHC-Ⅱ的表達。與未感染的對照組相比,BCG感染24 h后iPS-Mφ產(chǎn)生的NO和TNF-α的表達顯著增加(P0.01),細胞的凋亡率顯著升高(P0.01),Caspase-3的表達顯著增加(P0.01),而抑制了Bcl-2的表達顯著減低(P0.01)。本研究建立了從hiPS獲得具有功能活性的巨噬細胞的方法,并檢測了iPS-Mφ抗MTB感染的免疫機制,為闡明巨噬細胞在結(jié)核免疫中的作用機制提供新的途徑。
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【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R52
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本文編號：2429890