【摘要】：巨噬細(xì)胞(Macrophages,Mφ)是造血系統(tǒng)中最具可塑性的細(xì)胞,存在于所有的組織中,在細(xì)胞正常發(fā)育、體內(nèi)平衡、組織修復(fù)和對病原體的免疫反應(yīng)中扮演了許多不同的角色。結(jié)核(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的人獸共患慢性傳染病,是嚴(yán)重威脅人類健康的三大感染性疾病之一。在抗MTB感染的免疫應(yīng)答中,巨噬細(xì)胞是其主要的宿主細(xì)胞,所以研究巨噬細(xì)胞與MTB的相互作用對結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展起著非常重要的作用。目前實(shí)驗研究用人類巨噬細(xì)胞多來源于腫瘤細(xì)胞系和外周血單核細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系來源的巨噬細(xì)胞容易發(fā)生遺傳結(jié)構(gòu)改變,造成功能缺失,外周血來源的巨噬細(xì)胞則獲取困難且數(shù)量較少,如何獲取大量有功能活性的巨噬細(xì)胞是研究的關(guān)鍵,誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells,iPS)技術(shù)的出現(xiàn)為體外獲得大量巨噬細(xì)胞提供了新思路。iPS是通過體外導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)⒔K末分化的體細(xì)胞重編程為具有胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ES)特性的多能細(xì)胞,即能夠自我更新并可分化為3個胚層來源所有細(xì)胞的能力。iPS避免倫理道德和免疫排斥反應(yīng)等局限而備受青睞。研究已證實(shí)iPS在體外特定誘導(dǎo)條件下,能夠定向分化為巨噬細(xì)胞。iPS誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞的方法大致可以分為三類:(1)通過iPS形成類胚體(Embryonic body,EB);(2)與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9,S17等共培養(yǎng);(3)在基質(zhì)膠上添加不同細(xì)胞因子直接誘導(dǎo)分化。目前,iPS來源巨噬細(xì)胞的研究大都集中在腫瘤免疫等方面,尚缺乏iPS來源的巨噬細(xì)胞在抗結(jié)核免疫機(jī)理方面的研究。鑒于此,本研究以人iPS(human i PS,hiPS)為靶細(xì)胞,體外誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞,并探討了該巨噬細(xì)胞對卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)的免疫功能。本研究首先通過堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP),反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR),免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry),EB分化實(shí)驗等方法對hiPS進(jìn)行多能性的檢測,在此基礎(chǔ)上,通過EB形成無飼養(yǎng)層法和OP9共培養(yǎng)兩種方法誘導(dǎo)人i PS分化為巨噬細(xì)胞(iPS-Mφ),并對無飼養(yǎng)層法來源的iPS-Mφ進(jìn)行了細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、吉姆薩染色、非特異性酯酶染色(α-NAE)、吞噬功能和細(xì)胞表面特異性抗原表達(dá)檢測等一系列鑒定。最后,利用BCG感染體外培養(yǎng)iPS-Mφ,并分析BCG對iPS-Mφ一氧化氮(nitric oxide,NO)的產(chǎn)生、腫瘤壞死因子-alpha(tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達(dá)情況,同時以人單核細(xì)胞系THP-1來源的巨噬細(xì)胞(THP-1-Mφ)為對照。結(jié)果表明,hiPS經(jīng)AKP染色呈陽性,表達(dá)Oct-4和Nanog;所形成的類胚體表達(dá)內(nèi)胚層標(biāo)記基因AFP,中胚層標(biāo)記基因Gata-1和外胚層標(biāo)記基因Nestin,表明靶細(xì)胞hiPS具有多能干細(xì)胞特性,能夠用于后續(xù)分化實(shí)驗;無飼養(yǎng)層類胚體形成的方法和以O(shè)P9為飼養(yǎng)層兩種方法得到的iPS-Mφ具有巨噬細(xì)胞所特有的形態(tài)特征(圓形、橢圓形、梭形及不規(guī)則形等,部分細(xì)胞可見偽足和凸起);進(jìn)一步對iPS-Mφ進(jìn)行特性和功能鑒定發(fā)現(xiàn),iPS-Mφ吉姆薩染色和非特異性酯酶染色(α-NAE)染色陽性,并具有較強(qiáng)的吞噬能力,同時可檢測到特異性的表面抗原白細(xì)胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)CD14、CD11b、CD40、CD68和組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)MHC-Ⅱ的表達(dá)。與未感染的對照組相比,BCG感染24 h后iPS-Mφ產(chǎn)生的NO和TNF-α的表達(dá)顯著增加(P0.01),細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P0.01),Caspase-3的表達(dá)顯著增加(P0.01),而抑制了Bcl-2的表達(dá)顯著減低(P0.01)。本研究建立了從hiPS獲得具有功能活性的巨噬細(xì)胞的方法,并檢測了iPS-Mφ抗MTB感染的免疫機(jī)制,為闡明巨噬細(xì)胞在結(jié)核免疫中的作用機(jī)制提供新的途徑。
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【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R52
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本文編號：2429890