【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是一種嚴重危害人類健康的病原體,可導(dǎo)致急慢性乙型肝炎、肝硬化,并與肝細胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前臨床上尚無特異性根治慢性乙肝的手段,一般采用核苷類藥物及α干擾素(interferon, IFN)來抑制HBV復(fù)制以最大程度減輕和延緩HBV慢性感染所導(dǎo)致的肝臟免疫病理損傷。其中IFN-α作為具有直接抗病毒效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子是宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答的重要組成部分,其在體內(nèi)由宿主模式識別受體(Pattern Recognition Receptor, PRR)介導(dǎo)的通路誘生,并經(jīng)由Ⅰ型干擾素效應(yīng)通路發(fā)揮抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用。雖然大量體內(nèi)外研究已證實IFN-α具有抑制HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制的作用,但是臨床上慢性HBV感染患者對IFN-α治療的應(yīng)答率僅約30%,提示HBV可能存在拮抗Ⅰ型干擾素效應(yīng)通路的策略。 本課題組前期工作表明HBV編碼的多聚酶蛋白(polymerase, Pol)具有抑制IFN-α誘導(dǎo)的MyD88轉(zhuǎn)錄的功能。本研究旨在進一步明確Pol在HBV拮抗IFN-α效應(yīng)過程中的角色,在此基礎(chǔ)上深入觀察Pol對IFN-α激活的JAK-STAT (signal transducer and activator of transcription)通路的抑制作用,并揭示其中分子機制,以加深人們對HBV拮抗Ⅰ型干擾素通路及逃逸宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答機制的認識。 首先在HBV復(fù)制和Pol過表達的細胞中采用熒光報告基因檢測和實時熒光定量PCR確認了HBV和Pol對于IFN-α誘導(dǎo)的干擾素刺激反應(yīng)元件(ISRE)活化及下游抗病毒基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用。同時在基于高壓尾靜脈質(zhì)粒注射的小鼠轉(zhuǎn)染模型中也觀察到,HBV和Pol的表達抑制了mIFN-α誘導(dǎo)的小鼠干擾素刺激基因(ISGs)的轉(zhuǎn)錄。為從生物學意義上確認HBV和Pol的表達削弱了IFN-α介導(dǎo)的抗病毒天然免疫應(yīng)答,將VSV用作感染指示病毒行病毒保護實驗,免疫熒光觀察及細胞培養(yǎng)上清病毒滴定的結(jié)果均顯示,HBV和Pol的存在顯著削弱了IFN-α誘導(dǎo)的細胞抗VSV感染的能力。以siRNA干擾HBV復(fù)制細胞中Pol的表達后,HBV拮抗ISRE活化的能力明顯減弱,確認了Pol在HBV抑制IFN-α效應(yīng)過程中的重要角色。 為進一步探尋Pol對Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,通過免疫印跡及免疫熒光觀察了Pol對信號通路相關(guān)分子表達以及IFN-α誘導(dǎo)的STAT分子活化的影響,發(fā)現(xiàn)Pol對IFNAR1、IFNAR2、JAK1、Tyk2、STAT1、STAT2、IRF9、 Importin-α5等分子的本底表達,以及STAT1-701位酪氨酸磷酸化和STAT1-STAT2異聚體的形成無明顯影響,但Pol對與STAT1轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)的STAT1-727位絲氨酸磷酸化及STAT1、STAT2的入核有顯著抑制作用。小鼠高壓尾靜脈質(zhì)粒注射模型中的結(jié)果驗證了Pol對STAT1-727位磷酸化的抑制；而在IFN-α離體處理的慢性乙肝病人肝穿標本中,本研究首次證實相較未感染HBV肝細胞中STAT1和STAT2大多分布于核中,HBV感染肝細胞中的STAT1和STAT2則主要滯留于胞漿,有力地支持了細胞系內(nèi)觀察到的現(xiàn)象。 進一步深入研究發(fā)現(xiàn),Pol與負責調(diào)節(jié)STAT1-727位磷酸化的PKC (protein kinase C)-δ激酶蛋白的催化亞基存在相互作用,且抑制了IFN-α誘導(dǎo)的PKC-δ磷酸化及其與STAT1的結(jié)合。另一方面,免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示Pol以濃度依賴的方式抑制了核漿運輸?shù)鞍譏mportin-α5與STAT1和STAT2的相互作用；GST-pull down實驗和截短突變分析進一步顯示,Pol與核漿運輸?shù)鞍譏mportin-α5存在相互作用,且Pol與Importin-α5相互作用的區(qū)段和Importin-α5與STAT1-STAT2異聚體結(jié)合的區(qū)段互相重疊,提示Pol可能通過與Importin-α5的競爭性結(jié)合阻礙了其介導(dǎo)的STAT1和STAT2的入核。 鑒于Pol蛋白由末端蛋白(terminal protein, TP)、連接區(qū)(spacer, SP)、逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(reverse transcriptase, RT)和RNaseH (RH)區(qū)等構(gòu)成,通過構(gòu)建并轉(zhuǎn)染編碼Pol各個結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒,確定了TP區(qū)負責抑制PKC-δ介導(dǎo)的STAT1-727位磷酸化,RH區(qū)則負責抑制Importin-α5介導(dǎo)的STAT1、STAT2的入核；TP和RH兩個截短體單獨表達均具有和全長Pol表達類似的抑制IFN-α信號通路的效應(yīng)。 綜上所述,本研究確認了Pol在HBV拮抗Ⅰ型干擾素效應(yīng)通路方面的作用,并揭示了Pol通過與PKC-δ和Importin-a5的相互作用抑制IFN-a誘導(dǎo)的STAT分子活化的機制,為IFN-a治療慢性乙肝病人應(yīng)答率低及HBV建立和維持慢性感染提供了可能的機制解釋,同時為優(yōu)化IFN-a治療乙肝效果及開發(fā)新的靶向治療藥物提供了思路和理論基礎(chǔ)。
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【學位授予單位】：復(fù)旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62

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1 陳捷亮;乙型肝炎病毒多聚酶蛋白拮抗Ⅰ型干擾素通路的機制研究[D];復(fù)旦大學;2013年

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本文編號：2425757