【摘要】：背景 HIV等血源性職業(yè)暴露感染和醫(yī)源性感染是廣大醫(yī)務(wù)人員、公安司法干警和公眾最關(guān)心的問題之一。傳統(tǒng)的HIV暴露后感染溯源主要依賴于流行病學(xué)調(diào)查。國外有報(bào)道將分子流行病學(xué)技術(shù)用于HIV暴露后感染溯源調(diào)查,通過對可疑傳播鏈上不同個(gè)體體內(nèi)HIV準(zhǔn)種群(quasispecies)的基因高可變區(qū)核酸序列進(jìn)行分析,為HIV職業(yè)暴露感染鑒定、醫(yī)源性感染調(diào)查、司法調(diào)查等提供分子實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 溯源研究的方法主要有三種,分別是巢式PCR產(chǎn)物直接測序法、巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴(kuò)增法。巢式PCR產(chǎn)物直接測序法可以獲得優(yōu)勢準(zhǔn)種的序列,但弱勢準(zhǔn)種序列難以被檢出。而巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴(kuò)增法則可以同時(shí)獲得優(yōu)勢準(zhǔn)種和部分弱勢準(zhǔn)種,提供更多的準(zhǔn)種序列信息用于溯源分析。 本文分別建立了巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴(kuò)增法兩種基于準(zhǔn)種分析的HIV暴露后感染溯源研究方法,并用于調(diào)查一起疑似輸血感染HIV案例,為HIV傳播的流行病學(xué)調(diào)查提供分子實(shí)驗(yàn)室證據(jù),探討了兩種方法的適用性。 目的 1、建立兩種基于準(zhǔn)種分析的HIV暴露后感染溯源研究方法,分別是巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴(kuò)增法； 2、將建立的兩種方法分別用于一起疑似輸血感染HIV案例的溯源分析； 3、探討不同樣品類型(全血、血漿)對單基因擴(kuò)增法檢測結(jié)果有無影響。 材料和方法 1、采集可疑傳播鏈上3例HIV感染者(編號T1-T3)及作為對照的13例已知HIV感染者或艾滋病患者(編號C1-C13)血樣。 2、利用巢式PCR產(chǎn)物克隆法進(jìn)行溯源研究 先從采集的血漿樣品中提取RNA,然后對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR擴(kuò)增,挑選擴(kuò)增成功的產(chǎn)物進(jìn)行克隆,獲取準(zhǔn)種,測序后獲得準(zhǔn)種序列,對準(zhǔn)種序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。 3、利用單基因擴(kuò)增法進(jìn)行溯源研究 3.1血漿樣品 1)從血漿樣品中提取RNA； 2)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA; 3)將cDNA進(jìn)行梯度稀釋,摸索最佳稀釋度； 4)根據(jù)最佳稀釋度進(jìn)行96孔巢式PCR反應(yīng)； 5)對擴(kuò)增成功的孔進(jìn)行測序,獲得的準(zhǔn)種序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。 3.2全血樣品 1)分別從全血樣品中提取全核酸； 2)將全核酸逆轉(zhuǎn)錄為cDNA和前病毒DNA； 3)將cDNA和前病毒DNA進(jìn)行梯度稀釋,摸索最佳稀釋度； 4)以下步驟同血漿樣品。 結(jié)果 1、巢式PCR產(chǎn)物克隆法結(jié)果 1)在16份樣品中,成功擴(kuò)增出13份的核酸目的片段。最終獲得59個(gè)克隆的核酸序列,大部分克隆間的核酸序列不同。 2)對克隆的核酸序列進(jìn)行基因離散率分析：大部分樣品內(nèi)不同克隆間的平均基因離散率小于3%；分析T1與其它樣品間的基因離散率,與T2、T3、C12的基因離散率要小于與對照樣品間的基因離散率。因此提示T1、T2、T3和C12應(yīng)具有傳播關(guān)系。 3)對克隆的核酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析：T1、T2、T3和C12的所有克隆及C13的2個(gè)克隆聚為一簇,分支處自展(bootstrap)值為100%；T3部分克隆與T1、T2、C12聚為一簇,T3相對于T1、T2、C12來說應(yīng)當(dāng)是并系關(guān)系,在分子實(shí)驗(yàn)室方面T3為T1、T2、C12的傳染源。 2、單基因擴(kuò)增法結(jié)果 2.1血漿樣品 1)在16份樣品中,血漿樣品成功擴(kuò)增出15份的核酸目的片段,獲得153個(gè)準(zhǔn)種序列,大部分準(zhǔn)種間的核酸序列不同。 2)對準(zhǔn)種的核酸序列進(jìn)行基因離散率分析：大部分樣品內(nèi)不同準(zhǔn)種間的平均基因離散率小于4%；分析T1與其它樣品間的基因離散率,與T2、T3、C12的基因離散率要小于與對照樣品間的基因離散率。因此提示T1、T2、T3和C12應(yīng)具有傳播關(guān)系。 3)對準(zhǔn)種的核酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析：T1、T2、T3和C12的所有準(zhǔn)種聚為一簇,分支處自展(bootstrap)值為94%；T3部分準(zhǔn)種與T1、T2、C12聚為一簇,T3相對于T1、T2、C12來說應(yīng)當(dāng)是并系關(guān)系,在分子實(shí)驗(yàn)室方面T3為T1、T2、C12的傳染源。 4)對照樣品C5與C6進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,結(jié)合流行病學(xué)資料,判定C5為C6的傳染源。 2.2全血樣品 1)在16份樣品中,全血樣品成功擴(kuò)增出14份的核酸目的片段,獲得153個(gè)準(zhǔn)種序列,大部分準(zhǔn)種間的核酸序列不同。 2)在判定C2與C4的關(guān)系時(shí),血漿樣品和全血樣品得到的結(jié)果不同,全血樣品獲得的準(zhǔn)種可以得到C2為C4的傳染源的分子實(shí)驗(yàn)室證據(jù)而血漿樣品卻無法得到。除此之外,全血樣品與血漿樣品結(jié)果一致。 3、兩種方法的比較 兩種方法分別進(jìn)行HIV暴露后感染溯源研究時(shí)分析結(jié)果一致。研究結(jié)果顯示在亞型分型時(shí),巢式PCR產(chǎn)物克隆法得到的結(jié)果在判定對照樣品C8時(shí),僅能判定其為BC亞型,而單基因擴(kuò)增法可得到C8樣品為07-BC亞型的結(jié)果。 結(jié)論 1、建立了基于準(zhǔn)種分析的兩種HIV暴露后感染溯源檢測方法：巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴(kuò)增法。 2、將巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴(kuò)增法分別用于一起疑似輸血感染HIV案例的溯源分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持HIV從T3經(jīng)T2傳播到T1的流行病學(xué)調(diào)查線索,顯示分子流行病學(xué)技術(shù)可以為HIV暴露后感染溯源調(diào)查提供更直接的證據(jù)。兩種方法的檢測結(jié)果一致。 3、在HIV暴露后感染溯源研究中,單純實(shí)驗(yàn)室檢測數(shù)據(jù)不能判定傳播關(guān)系,需與流行病學(xué)資料相結(jié)合使用。 4、利用單基因擴(kuò)增法溯源分析時(shí),對于感染時(shí)間較長的感染者,使用全血樣品比使用血漿樣品得的準(zhǔn)種信息更多。
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【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R512.91

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 焦麗燕;劉永健;郭東星;王錚;耿慶茂;李林;莊道民;鮑作義;劉思揚(yáng);李韓平;李敬云;;兩種HIV-1耐藥準(zhǔn)種分析方法的比較[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2010年03期

2 梁浩;羅皓;邵一鳴;劉偉;張志勇;邢輝;盧燦健;沈菁;麥志丹;;廣西HIV-1重組毒株env區(qū)快速基因分型方法的建立[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;2006年03期

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本文編號：2383616