發(fā)布時間：2018-12-12 04:12

【摘要】：目的：核苷酸類似物阿德福韋酯是臨床常用的抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)藥物,然而長期使用會導致耐藥的發(fā)生。經(jīng)典的阿德福韋酯耐藥變異形式為rtN236T和rtA181V,關(guān)于rtN236位點尚未見其他耐藥相關(guān)變異的報道。本研究旨在鑒定分析兩例阿德福韋酯治療失敗的慢性乙肝患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase, RT)區(qū)新變異rtN236V的表型耐藥特點。方法：1.分別從兩例阿德福韋酯治療失敗的慢乙肝患者血清中提取HBVDNA,采用巢式聚合酶鏈反應(PCR)擴增HBV RT區(qū),分別將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-Teasy載體,患者1挑選16個克隆,患者2挑選34個克隆進行DNA測序并分析與耐藥相關(guān)的突變形式。2.用Xho Ⅰ/Sph Ⅰ雙酶切pGEM-Teasy RT克隆載體及pTriEX-HBV(C)1.1倍表達載體,構(gòu)建1.1倍HBV野生株和耐藥株的重組載體。3.將重組后的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系HepG2細胞,轉(zhuǎn)染4h后分別加入不同濃度的拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋和替諾福韋酯,隔天更換含不同藥物濃度的培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)染后第四天收集細胞培養(yǎng)液,然后采用實時熒光定量PCR方法檢測在不同藥物濃度作用下細胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA的產(chǎn)量,并分析其表型耐藥特點。分別進行三次獨立重復實驗。結(jié)果：1.患者1接受阿德福韋酯治療20個月后出現(xiàn)病毒學突破和生化學突破,之后加用拉米夫定治療6個月后再次出現(xiàn)生化學突破,此時患者血清HBV DNA RT區(qū)克隆測序結(jié)果顯示16個克隆中,13個(81.25%)為rtN236V變異株,2個(12.5%)為rtN236T突變株,1個(6.25%)為野生株�；颊�2經(jīng)阿德福韋酯單一治療15個月后效果不佳,出現(xiàn)病毒學突破和生化學突破,此時患者血清HBV DNA RT區(qū)克隆測序結(jié)果顯示34個克隆中,20個(59%)為rtN236V變異株,11個(32%)為rtN236T變異株,2個(6%)為野生株,1個(3%)為rtA181V+N236V變異株。2.分別獲取經(jīng)過Xho I/Sph Ⅰ雙酶切后的pGEM-Teasy RT區(qū)及pTriEX-HBV(C)1.1載體,經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化等步驟成功構(gòu)建1.1倍HBV重組載體質(zhì)粒。3.分別將構(gòu)建好的重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細胞中,表型耐藥結(jié)果分析顯示：患者1：rtN236T和rtN236V變異株的相對病毒復制力分別為野生株的84.76%,80.02%；患者2:rtN236T、rtN236V和rtA181V+N236V變異株的相對病毒復制力分別為野生株的89.43%,83.60%和66.44%；在體外實驗中,患者1和患者2分離的rtN236V變異株與野生株相比對阿德福韋酯的敏感性分別降低了3.90倍和3.10倍,rtN236T變異株與野生株相比對阿德福韋酯的敏感性分別降低了4.50倍和4.75倍,從患者2分離的rtA181V+N236V變異株與野生株相比對阿德福韋酯的敏感性降低了5.10倍,而三種變異株對拉米夫定、恩替卡韋和替諾福韋酯均敏感。結(jié)論：首次在阿德福韋酯長期治療失敗的慢乙肝患者血清病毒池中鑒定新的變異形式rtN236V,并與rtN236T和rtA181V株伴隨存在,表型耐藥結(jié)果顯示rtN236V變異在一定程度上降低了病毒的復制力,同時也降低了病毒對阿德福韋酯的敏感性,提示該變異是一種新的阿德福韋酯耐藥相關(guān)變異。
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【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2373880