【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染人體后可以引起丙型肝炎,是造成人類肝病的一個(gè)主要原因。丙型肝炎在全世界范圍都有報(bào)道,國(guó)際衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全世界大約有1億8千萬(wàn)人受到了丙型肝炎病毒的感染,并以每年新增3.5萬(wàn)人的速度在增加。丙型肝炎病毒具有嚴(yán)格的種屬特異性,只有人類和黑猩猩可以被丙型肝炎病毒感染,而黑猩猩成本昂貴,加之倫理學(xué)等因素,極大的限制了丙型肝炎病毒動(dòng)物感染模型的建立。因此,人類一直處于一個(gè)缺乏丙型肝炎病毒動(dòng)物感染模型的境地,極大的限制了開(kāi)發(fā)新型抗病毒藥物以及疫苗的研究。雖然科學(xué)家一直致力于丙型肝炎病毒的研究,來(lái)預(yù)防和治療丙型肝炎持續(xù)感染,但是丙型肝炎病毒感染的分子機(jī)制一直沒(méi)有被明確的闡述。GB病毒-B (GBV-B)的出現(xiàn)使很多研究HCV的學(xué)者開(kāi)始注重另一項(xiàng)研究,就是開(kāi)發(fā)一種GBV-B感染小型靈長(zhǎng)類動(dòng)物替代模型,來(lái)模擬HCV在人類體內(nèi)感染的過(guò)程。 GBV-B是一種與丙型肝炎病毒(HCV)非常相近的病毒,同屬黃病毒科肝病毒屬。這種病毒早在40年前被描述,它是將處在HCV感染急性期的病人血清注射到絹毛猴體內(nèi),經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后,將這只絹毛猴血清繼續(xù)注射到另外一只健康的絹毛猴體內(nèi),這樣經(jīng)歷了很多次傳代后,從絹毛猴體內(nèi)得到的一種可以感染絹毛猴并可以引起肝炎的RNA病毒。除了絹毛猴,GBV-B還可以感染絨科動(dòng)物中的普通棉耳絨猴。引起它們類似人類肝炎的癥狀。有一些學(xué)者還構(gòu)建了HCV/GBV-B嵌合病毒,將HCV的5'-NCR、HVR1、p7等小基因片段(212bp),甚至是HCV完整結(jié)構(gòu)蛋白基因替換到GBV-B中,用嵌合病毒感染普通棉耳狨猴,希望能夠更準(zhǔn)確真實(shí)地模擬HCV在靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)的活動(dòng)狀態(tài)。 普通棉耳絨猴屬新世界小型靈長(zhǎng)類動(dòng)物,與絹毛猴同屬絨科。普通棉耳狨猴可以被GBV-B感染并產(chǎn)生類似人類肝炎的癥狀。因此,可以用來(lái)作為一種替代模型來(lái)研究丙型肝炎病毒的感染。這種小動(dòng)物具有體小(成年體重350g到400g)、繁殖率高、進(jìn)食少、費(fèi)用相對(duì)于黑猩猩低、易在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)籠養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,清楚的主要組織相容性復(fù)合體多態(tài)性信息是必不可少的,尤其是I型主要組織相容性復(fù)合體與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。目前我們對(duì)普通棉耳狨猴的主要組織相容性復(fù)合體多態(tài)性信息的了解卻知之甚少。 Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體具有高度的多態(tài)性,在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中,起到了識(shí)別病原體的功能。另外,在CD8陽(yáng)性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)中,對(duì)于病毒的清除存在著明顯的個(gè)體差異,有些個(gè)體會(huì)自然清除,而有些個(gè)體卻會(huì)持續(xù)感染,在這個(gè)現(xiàn)象中,個(gè)體之間存在著不同的Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體等位基因是主要的一個(gè)因素。因此,作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,清晰的Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體多態(tài)性背景資料是必要的。普通棉耳狨猴的種系相對(duì)來(lái)說(shuō)比較單純,很適合用來(lái)研究主要組織相容性復(fù)合體介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。到目前為止,對(duì)于普通棉耳狨猴Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體的等位基因的研究還很有限,只有少數(shù)幾條等位基因被發(fā)現(xiàn)。在本研究中,從9只用來(lái)研究HCV/GBV-B絨猴感染模型的普通棉耳狨猴中分離出了Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體全長(zhǎng)基因并對(duì)這些基因進(jìn)行了比對(duì)分析。 首先,利用TRIzol將絨猴總RNA從絨猴的外周血單個(gè)核細(xì)胞中分提取出來(lái),并妥善保存。設(shè)計(jì)并合成了兩對(duì)針對(duì)絨猴Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體的引物,這兩對(duì)引物是來(lái)自文獻(xiàn)中報(bào)道的擴(kuò)增恒河猴Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體的引物。利用RT-PCR的方法,成功的從絨猴總RNA中擴(kuò)增出了全長(zhǎng)的Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體基因。擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)約1100bp,采用了1%凝膠電泳的方法進(jìn)行了鑒定,將大小正確的片段采用切膠回收的方式進(jìn)行純化后,將純化過(guò)的擴(kuò)增產(chǎn)物連接至PMD-T載體上,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TOP10,挑取單克隆,酶切鑒定后并將所有的陽(yáng)性克隆送往華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。 利用DNAMAN5.2.2軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì),并將核苷酸序列翻譯為氨基酸序列,利用MEGA4.1軟件制作系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析。進(jìn)化樹(shù)采用從Genbank中下載的其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物的Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體的等位基因作為參考序列。參考序列包括普通棉耳絨猴的MHC class I:Caja-A (xr_091099.1), Caja-B (xm_002764215.1), Caja-C (xm_002763560.1), Caja-E (ef014284.1), Caja-GOl (u59637.1), Caja-G03(u59639.1), Caja-G04(u59640.1), Caja-G05(u59641.1);人類的MHC class I:HLA-A (nm_002116.7), HLA-B (nm_005514.6), HLA-C (nm_002117.4), HLA-E (nm_005516.5), HLA-F (nm_018950.2), HLA-G (nm_002127.5),恒河猴：Mamu-A (gu592059.1), Mamu-B (ef580173.1), Mamu-E (nm_001114966.1), Mamu-F (nm_001042770.2),以及黑猩猩：Patr-A (dq539672.1), Patr-B (dq539675.1), Patr-C (afl65370.1), Patr-E (nm_001045498.1), Patr-F (nm_001129198.1), Patr-G (nm_001045512.1)。本研究新發(fā)現(xiàn)的絨猴Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體的等位基因提交NCBI Genbank后遞交免疫多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(IPD)進(jìn)行命名。 本研究中,共挑選了355個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序,這些克隆分別來(lái)自9只絨猴,每只絨猴所提供的克隆數(shù)從15到92個(gè)不等。由于試驗(yàn)方法的限制,為了確保這些克隆并非是由于人為原因產(chǎn)生的變異,我們確立了一個(gè)選取陽(yáng)性克隆的方法,即單倍型克隆數(shù)≥2才可以認(rèn)為是確實(shí)存在的等位基因,基于此規(guī)則,從9只絨猴中,共發(fā)現(xiàn)了26條新的MHC-I等位基因。并對(duì)這26條等位基因以及24條參考序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析。 在26個(gè)新發(fā)現(xiàn)的等位基因中,有15個(gè)Caja-G等位基因,并且他們可以翻譯成完整的功能蛋白。另外11個(gè)等位基因是假基因,其中6個(gè)為Caja-C假基因和5個(gè)為Caja-G假基因。這些假基因由于編碼框移位或者是堿基缺失,導(dǎo)致其不能翻譯成完整的功能蛋白。另外,有6個(gè)假基因都恰巧缺失了編碼α2蛋白的基因。將15個(gè)Caja-G等位基因提交Genbank獲得序列號(hào)并遞交IPD進(jìn)行命名。 在這些序列中,2條序列m01-caja-a16和m13-caja-a09分布在3只絨猴中,5條序列分布在2只絨猴中,剩下的8個(gè)等位基因均出現(xiàn)在1只不同的絨猴個(gè)體中。并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一條等位基因出現(xiàn)在所有或者大部分的絨猴中。新發(fā)現(xiàn)的Caja-G等位基因與Genbank中的Caja-G參考序列相似度高達(dá)96%。在Genbank中,目前只有少數(shù)幾條Caja-G序列,因而Caja-G等位基因還應(yīng)該被更精確的進(jìn)行詳細(xì)劃分。 將這15條新發(fā)現(xiàn)的可以翻譯為完整功能蛋白的等位基因利用DNAMAN軟件翻譯為氨基酸序列。并進(jìn)行兩兩相比。這15條等位基因可以翻譯成兩種大小的功能蛋白,一種大小為359個(gè)氨基酸,另一種大小為362個(gè)氨基酸。而所有這15條等位基因核苷酸兩兩相比后相似度為89.54%到99.91%,氨基酸兩兩相比后相似度為83.51%到100%。m13-caja-a09和m15-caja-a06這兩條等位基因具有不同的核苷酸序列,但可以翻譯成相同的蛋白。 根據(jù)Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體分子的重鏈部分不同的功能,可以將其分為五個(gè)區(qū)域,包括三個(gè)胞外區(qū)(分別記作α1,α2和α3),一個(gè)跨膜區(qū)以及一個(gè)胞漿區(qū)。Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體多態(tài)性主要集中在α1,α2區(qū)域中,在本研究中新發(fā)現(xiàn)的等位基因氨基酸序列中,高變區(qū)主要集中在三處,分別是第62到83位氨基酸,第92到121位氨基酸以及第152-179位氨基酸,而人類HLA超高變區(qū)的位置分別位于第62到83位氨基酸,第92到121位氨基酸以及第135到157位氨基酸。這些區(qū)域的高度多態(tài)性是非常重要的,因?yàn)檫@些區(qū)域所編碼的蛋白共同組成了Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體分子的肽結(jié)合位點(diǎn)。另外,在a3中有一處非常保守的位點(diǎn),包含有7個(gè)氨基酸,這7個(gè)氨基酸與CD8陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)。 總而言之,本課題通過(guò)對(duì)9只普通棉耳絨猴進(jìn)行研究,新發(fā)現(xiàn)了15個(gè)新的Caja-G等位基因,這15個(gè)等位基因可以翻譯Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體完整的功能蛋白。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了6個(gè)Caja-C假基因以及5個(gè)Caja-G基因。說(shuō)明了絨猴這一物種具有高度的MHC class I基因多態(tài)性,這些研究資料增加了我們對(duì)絨猴MHC遺傳背景的認(rèn)識(shí)。而且還為HCV/GBV-B絨猴感染模型中的CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)研究提供了非常有用的信息。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2251411