【摘要】：TRIM5α作為一種抑制HIV-1復(fù)制的細(xì)胞因子，首先在恒河猴細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。TRIM5α是TRIM5基因編碼的六種亞型中的一種，它的結(jié)構(gòu)包括RING結(jié)構(gòu)域、B-box2結(jié)構(gòu)域、Coiled-coil結(jié)構(gòu)域以及其他TRIM5亞型中不具備的位于羧基端的B30.2結(jié)構(gòu)域。 病毒外膜與宿主細(xì)胞膜融合進(jìn)入細(xì)胞后，病毒衣殼有序解體釋放核酸之前，TRIM5α蛋白多聚體可以與病毒衣殼特異性地結(jié)合。TRIM5α具有的泛素連接酶活性，使衣殼通過泛素依賴的蛋白酶體途徑被降解，病毒衣殼的不成熟解體阻斷了病毒的復(fù)制周期，從而達(dá)到抑制病毒的目的。TRIM5α蛋白的抗反轉(zhuǎn)錄病毒活性具有鮮明的種屬特異性，與其B30.2域中特定的氨基酸有關(guān)。 本課題采用重疊PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，將人的野生型TRIM5α基因B30.2區(qū)域的第332位精氨酸突變?yōu)榱涟彼帷⒔z氨酸和谷氨酰胺，，構(gòu)建出點(diǎn)突變的TRIM5α真核表達(dá)載體。另外將人的野生型TRIM5α進(jìn)行片段替換，構(gòu)建出含有TFP基序的TRIM5α真核表達(dá)載體。亞細(xì)胞定位研究顯示野生型及突變型GFP-TRIM5α融合蛋白主要分布在胞漿中，過表達(dá)時(shí)出現(xiàn)點(diǎn)狀聚集的現(xiàn)象。突變位點(diǎn)的存在不影響蛋白質(zhì)的定位。瞬時(shí)表達(dá)TRIM5α突變體，同時(shí)包含TFP基序和R332P點(diǎn)突變的小片段TRIM5αRHE突變體具有較高的抗病毒活性，突變體R332Q和RH的作用次之，三者的抗HIV-1活性均高于R332P。
[Abstract]:As a cytokine that inhibits HIV-1 replication, TRIM5 偽 was first found in rhesus monkey cells as one of the six subtypes encoded by TRIM5 gene. Its structure includes the RING domain, B-box2 domain, Coiled-coil domain, and the B30.2 domain at the carboxyl terminal, which is not found in other TRIM5 subtypes. After fusion of virus outer membrane and host cell membrane into cells, virus capsid disintegrates and releases nucleic acid in an orderly manner, and TRIM5 偽 protein polymer can specifically bind to virus capsid. TRIM5 偽 has ubiquitin ligase activity. The capsid was degraded through the ubiquitin dependent proteasome pathway, and the premature disintegration of the virus capsid blocked the replication cycle of the virus. Thus, the antiretrovirus activity of TRIM5 偽 protein had a distinct species specificity. It is related to the specific amino acids in the B30.2 domain. In this study, a point mutant eukaryotic expression vector of TRIM5 偽 was constructed by mutating the 332nd arginine of human wild-type TRIM5 偽 gene B30.2 into leucine, serine and glutamine by using overlapping PCR site-directed mutation technique. In addition, TRIM5 偽 eukaryotic expression vector containing TFP motif was constructed by replacing human wild-type TRIM5 偽 fragment. Subcellular localization showed that wild-type and mutant GFP-TRIM5 偽 fusion proteins were mainly distributed in the cytoplasm. The presence of mutation sites does not affect the localization of proteins. The short fragment TRIM5 偽 RHE with TFP motif and R332P point mutation had higher antiviral activity, followed by R332Q and RH. The anti-HIV-1 activity of the three mutants was higher than that of R332P.
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R512.91

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本文編號：2252345