【摘要】：研究背景 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)簡稱乙肝病毒,是一種小環(huán)型部分雙鏈DNA病毒,其基因組至少包含S(包含S基因、PreS1基因和PreS2基因)、C、X、P等4個開放讀碼框架,分別編碼包膜抗原(HBs)、核心蛋白(HBc)、X蛋白(HBx)和DNA聚合酶。HBV屬于嗜肝病毒屬,但沒有直接的肝細(xì)胞毒性,病毒感染后引發(fā)的免疫性肝損傷是其致病的重要機(jī)制,HBV感染后可進(jìn)一步導(dǎo)致肝硬化或肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前全世界HBV感染人數(shù)已超過4億,每年約100余萬人死于HBV相關(guān)肝病,因HBV相關(guān)疾病死亡的人數(shù)占全球40%左右,因此,HBV是目前危害人類健康的主要?dú)⑹种?但HBV感染致免疫性肝損傷的作用尚不十分清楚,其致病機(jī)制亟待于深入探討。 長期以來,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HBV的成功清除與體內(nèi)較強(qiáng)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān),然而,越來越多的證據(jù)表明固有免疫在HBV感染及致病過程中發(fā)揮重要作用,明確HBV感染引發(fā)的免疫效應(yīng)及分子機(jī)制對于HBV相關(guān)肝病的診斷和治療極為關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn),HBV感染后是由肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞識別,主要由枯否氏細(xì)胞(Kupffer cell,KC)識別。KC是肝臟中定居的巨噬細(xì)胞,占全身巨噬細(xì)胞總數(shù)的80%-90%,是體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群,也是肝內(nèi)主要的炎性反應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞因子來源,KC通過產(chǎn)IL-1β、IL-18等炎癥因子參與各種慢性肝病過程中肝損傷的發(fā)生與發(fā)展。 IL-1β和IL-18的產(chǎn)生依賴于炎性體的激活。炎性體(也稱炎癥小體)是Tschopp等于2002年首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的,第-個被發(fā)現(xiàn)的炎性體是NLRP1炎性體。隨著研究的深入,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的炎性體有NLRP3(或NALP3).NLRC4.AIM2、RIG-I炎性體等,其中,NLRP3炎性體被研究得最多,NLRP3分子通過接頭蛋白ASC招募Caspase-1,從而組成多蛋白復(fù)合物即NLRP3炎性體。多種病毒感染可介導(dǎo)NLPR3炎性體的活化,NLRP3炎性體即可感應(yīng)RNA病毒如流感病毒、丙型肝炎病毒(HCV),也可感應(yīng)DNA病毒如腺病毒、水痘-帶狀皰疹病毒,由此說明無包膜的小分子DNA病毒或有包膜的大分子DNA病毒都可調(diào)節(jié)NLRP3炎性體的活化。炎性體的激活可使Caspase-1活化進(jìn)而對IL-1β或IL-18前體進(jìn)行剪切,促進(jìn)IL-1β或IL-18的成熟和釋放,引起炎癥反應(yīng)。 文獻(xiàn)報(bào)道,IL-18、IL-1β啟動子基因多態(tài)性與HBV感染后的疾病進(jìn)程及預(yù)后密切相關(guān),HBx蛋白和HBc蛋白可誘導(dǎo)IL-18的產(chǎn)生,慢乙肝患者血清中IL-1β的水平顯著高于正常人,且乙肝患者體內(nèi)IL-1β的水平與HBV病毒滴度呈正相關(guān)。那么HBV如何調(diào)節(jié)IL-1β和IL-18的產(chǎn)生呢?目前尚未見相關(guān)研究的報(bào)道,本文首次探討了HBV對NLRP3炎性體的調(diào)節(jié)作用。 T細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白樣蛋白(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain, Tim)家族是McIntire于2001年發(fā)現(xiàn)并鑒定的與哮喘和過敏性疾病相關(guān)的一個新基因家族。小鼠Tim基因家族位于染色體11B1.1,目前共發(fā)現(xiàn)8個基因,編碼蛋白Tim-l-Tim-4和4個假想基因Tim-5-Tim-8。人類TIM家族只有3個基因,定位于染色體5q33.2,分別編碼蛋白TIM-1、TIM-3、TIM-4。Tim蛋白是一類具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白,其結(jié)構(gòu)包括免疫球蛋白(IgV)樣區(qū)、黏蛋白(Mucin)樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。除Tim-4外,Tim-1、Tim-2、Tim-3胞內(nèi)區(qū)均含有酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn),直接參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 Tim-4分子在免疫調(diào)節(jié)及維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。Tim-4是Tim-1的天然配體,主要表達(dá)在活化的抗原提呈細(xì)胞表面,能維持腹腔巨噬細(xì)胞平衡,Tim-4與Tim-1相互作用可為T細(xì)胞提供協(xié)同刺激信號,Tim-4對T細(xì)胞的活化具有雙重調(diào)控作用,而Tm-4對巨噬細(xì)胞具有負(fù)調(diào)控作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),Tim-4過表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生,在ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)輸Tim-4過表達(dá)的巨噬細(xì)胞系可抑制IL-1β的產(chǎn)生,提示Tim-4可能抑制炎性體的活化。另外,發(fā)現(xiàn)慢乙肝患者PBMCs、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝單個核細(xì)胞中Tim-4的表達(dá)水平顯著減低,那么HBV如何調(diào)節(jié)Tim-4的表達(dá),是否通過調(diào)節(jié)其啟動子活性進(jìn)而影響其表達(dá)呢?HBV是否通過調(diào)節(jié)Tim-4的表達(dá)影響NLRP3炎性體的活性呢? 本文基于相關(guān)問題進(jìn)行了初步探討。 研究目的 明確HBV對NLRP3炎性體活性的影響,并初步探討其作用機(jī)制；構(gòu)建人TIM-4啟動子報(bào)告基因載體并鑒定其活性；探討TIM-4對NLRP3炎性體活性的影響。 方法 第一部分：HBV對NLRP3炎性體活化的影響 1臨床標(biāo)本檢測 (1)收集慢乙肝患者及健康對照血漿標(biāo)本 收集了56例慢乙肝患者的初診病人和20例健康對照組的肝素抗凝血，，離心取取上清,-20℃保存。 (2)ELISA檢測血漿中IL-1β的水平 利用ELISA試劑盒檢測初診的慢乙肝病人以及健康對照組的血漿中IL-1β的水平。 2.動物實(shí)驗(yàn) (1)H3V轉(zhuǎn)基因小鼠及正常對照 取鑒定為陽性的8-12周齡的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(Balb/c)35只,以及由山東大學(xué)動物中心提供的,12只同齡Balb/c小鼠為正常對照。 (2)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清DNA及抗原的檢測 分批處死HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,摘眼球取血，溫放置2h,4℃離心收取上清,檢測HBV DNA及表面抗原。 (3)ELISA檢測血清中IL-1β的水平 用ELISA試劑合檢測HBV轉(zhuǎn)基因小鼠與健康對照鼠血清中的IL-1β (4) Western blot檢測小鼠肝組織中Caspase-1的活化 隨機(jī)選取14例HBV轉(zhuǎn)基因小鼠及s猿６哉招∈蟮母巫櫓

本文編號：2251322