本文選題：HIV-1 + 組胺　； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：目的 為了探討肥大細胞及其釋放的過敏介質(zhì)對于HIV-1黏膜感染的影響，1.建立獲取和培養(yǎng)人原代肥大細胞的方法；2.以不成熟樹突狀細胞為研究對象，經(jīng)肥大細胞釋放的介質(zhì)組胺和HIV-1干預(yù)后，檢測樹突狀細胞的活化及促進初始CD4~+T細胞分化能力的改變情況，以便于更好地理解過敏和HIV-1感染的關(guān)系以及HIV-1的致病機理，為疾病的治療提供新思路。 方法 1.用細胞因子SCF、IL-6和IL-3刺激CD34~+造血干細胞使之分化成肥大細胞；Percoll密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠分選法，分離腸道黏膜肥大細胞。應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)分析所獲得的原代肥大細胞表面分子CD117和FcεRⅠ，通過甲苯胺藍染色或間接免疫熒光染色檢測胞內(nèi)類胰蛋白酶含量。 2.首先用免疫磁珠分選技術(shù)從外周血單個核細胞（Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）中分選出單核細胞，體外培養(yǎng)時加入GM-CSF和IL-4，使其分化為不成熟樹突狀細胞（immaturedendriticcells，iDC）。接著用組胺和/或單次感染HIV-1假病毒JRFL處理iDC，通過流式細胞術(shù)（FCM）觀察DC表型的變化，并提取各種處理后DC的RNA，通過實時熒光定量PCR（real-timePCR）檢測DC分泌的細胞因子，同時也用FCM從蛋白水平對細胞因子進行定量檢測。之后，將不同處理的DC與從PBMC分選出的初始CD4~+T細胞（naveCD4~+Tcell）或靜息CD4~+T細胞進行共培養(yǎng)，通過流式細胞術(shù)觀察DCs促T細胞增殖和調(diào)節(jié)性T細胞（regulatoryCD4~+Tcell，Treg）分化能力的改變。用real-timePCR和FCM檢測不同處理組DC上吲哚2,3雙加氧酶（indoleamine2,3-dioxygenase，IDO）的表達情況，通過加入IDO拮抗劑1-甲基色氨酸（1-MT），觀察DC功能的改變是否和IDO相關(guān)。再針對DC上組胺受體表達情況，加入吡拉明（pyrilamine，H1R拮抗劑），西咪替�。╟imetidine，H2R拮抗劑）和噻普酰胺（thioperamide，H3R和H4R拮抗劑），用real-timePCR檢測，找出與IDO產(chǎn)生相關(guān)的組胺受體。 結(jié)果 1.黏膜肥大細胞及CD34~+造血干細胞刺激分化而來的肥大細胞均表達CD117和FcεRⅠ，胞內(nèi)均含有類胰蛋白酶。 2.iDC上表達組胺受體H1R,H2R和H4R，幾乎不表達H3R；與未處理組DC相比，組胺和單次感染HIV-1假病毒JRFL單獨處理組不能引起或僅在一定程度上能促使DC表面CD86、CD83和HLA-DR表達增加，但二者共處理組的DC上CD86和CD83表達明顯增加（P0.05），趨向于活化、成熟；與未處理組比較，組胺和JRFL單獨處理組均促進了DC分泌IL-10，在共處理組，組胺可增強JRFL引起的IL-10的分泌，而降低JRFL引起的IL-12的分泌，對于JRFL引起的TGF-β僅有較弱的促進作用，對于IL-6的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；在DC功能檢測方面，組胺和JRFL單獨處理組的DC對于靜息CD4~+T細胞和初始CD4~+T細胞的增殖沒有或僅有較弱的影響，而共處理組的DC可明顯促進靜息CD4~+T細胞（P0.05）和初始CD4~+T細胞（P0.05）的增殖；在DC促進初始CD4~+T細胞向Tregs分化方面，共處理組也具有更明顯的效應(yīng)（P0.05），該組分化后T細胞的抑制增殖能力也更強（P0.05）；與未處理組相比，組胺和JRFL均可促進IDO的產(chǎn)生，而共處理組的IDO表達（mRNA水平和蛋白水平）明顯增加（P0.05），分化后Tregs的抑制增殖能力可被IDO拮抗劑1-MT所逆轉(zhuǎn)，提示Treg的分化與IDO相關(guān)；當(dāng)加入組胺H2R阻斷劑西咪替丁，DC上IDO的表達明顯降低（P0.05），提示組胺是通過結(jié)合DC上H2R導(dǎo)致IDO的產(chǎn)生。 結(jié)論 1.兩種方法均可以有效地獲得大量純化的原代肥大細胞，且各有優(yōu)勢，所得細胞適用于肥大細胞在HIV-1黏膜感染方面的后續(xù)研究。 2.肥大細胞釋放的介質(zhì)組胺參與了HIV-1對于不成熟DC的感染過程中，降低促炎細胞因子的產(chǎn)生，，促進抑制性細胞因子的分泌，并且通過H2R輔助HIV-1，刺激DCs產(chǎn)生更多IDO，誘導(dǎo)初始CD4~+T細胞朝向調(diào)節(jié)性T細胞分化，進一步促進免疫抑制環(huán)境的產(chǎn)生。
[Abstract]:Purpose

To investigate the effects of mast cells and their release on HIV - 1 mucosal infection , 1 . Methods of obtaining and culturing human primary mast cells were established .
2 . In order to better understand the relationship between allergy and HIV - 1 infection and the pathogenesis of HIV - 1 , we provide a new idea for the treatment of diseases .

method

1 . Using cytokines SCF , IL - 6 and IL - 3 to stimulate CD34 ~ + hematopoietic stem cells to differentiate into mast cells ;
The expression of CD117 and Fc.epsilon . R鈪

本文編號：1834935