本文選題：HBV + 鎖式探針　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：背景： 資料顯示全球約3.6億人為乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）攜帶者，HBV的持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化與肝癌等嚴(yán)重后果。核苷酸類似物（nucleotideanalogs；NAs）抗病毒藥物的使用是目前抗HBV治療的有效方法。但由于HBV聚合酶缺乏校正功能，導(dǎo)致其基因突變頻率較高，一旦藥物作用的靶基因發(fā)生變異，NAs藥物即失去對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用，從而產(chǎn)生臨床耐藥現(xiàn)象。目前，HBV耐藥基因檢測(cè)方法主要包括：直接測(cè)序法、實(shí)時(shí)定量多重PCR法、基因芯片法等。但上述方法存在以下不足：①儀器設(shè)備要求高：不僅需要PCR儀，同時(shí)還須具備DNA測(cè)序儀、基因芯片閱讀儀等昂貴儀器，中小醫(yī)療機(jī)構(gòu)無(wú)法滿足。②檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，成本高：檢測(cè)周期從幾小時(shí)到數(shù)天，耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)成本高，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)沉重。③操作復(fù)雜：對(duì)操作人員素質(zhì)要求較高，且工作量巨大，難以在中小醫(yī)療機(jī)構(gòu)常規(guī)開(kāi)展。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、成本低廉的HBV耐藥基因檢測(cè)新技術(shù)是HBV防治領(lǐng)域急需解決的一個(gè)重要問(wèn)題。 鎖式探針-滾環(huán)擴(kuò)增（Padlock probe-Rolling circle amplification,PLP-RCA）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。PLP由兩端識(shí)別序列和中間連接序列組成。當(dāng)兩端識(shí)別序列和靶序列完全互補(bǔ)雜交時(shí)，其末端堿基彼此相鄰，在DNA連接酶的作用下，連接成環(huán)狀DNA分子。環(huán)化的PLP恰可作為RCA擴(kuò)增反應(yīng)的模板，在引物和聚合酶的作用下進(jìn)行RCA擴(kuò)增反應(yīng)。該技術(shù)與其它核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，具有高特異性、高靈敏度和操作簡(jiǎn)易性的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。由于PLP只有在兩端識(shí)別序列與靶序列完全互補(bǔ)時(shí)才能啟動(dòng)RCA擴(kuò)增反應(yīng)。因此，PLP具備單堿基差異的識(shí)別能力，在耐藥位點(diǎn)檢測(cè)領(lǐng)域獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。另外，RCA為恒溫?cái)U(kuò)增，不需昂貴的儀器設(shè)備，能有效降低檢測(cè)成本。因此，PLP-RCA技術(shù)具備簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)HBV耐藥基因的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。 目的： 基于PLP和RCA擴(kuò)增技術(shù)，以HBV替諾福韋（TDF）耐藥基因突變位點(diǎn)為研究對(duì)象，建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、成本低廉的HBV耐藥基因突變位點(diǎn)檢測(cè)新方法。 方法： 1.鎖式探針設(shè)計(jì)：比對(duì)近年國(guó)內(nèi)HBV B型流行病毒株基因組序列，篩選適合設(shè)計(jì)鎖式探針的替諾福韋耐藥基因突變位點(diǎn)。以其為模板設(shè)計(jì)HBV野生型PLP探針和引物。同時(shí)利用Primer Premier5.0軟件預(yù)測(cè)探針和引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 2.建立RCA擴(kuò)增體系：以合成的含TDF耐藥基因突變位點(diǎn)的HBV野生型序列為模板，建立RCA擴(kuò)增體系，驗(yàn)證所設(shè)計(jì)探針、模板和引物的有效性。 3.RCA擴(kuò)增體系實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化：分別探討在35℃、40℃、45℃、50℃和55℃條件下鎖式探針與模板雜交對(duì)探針連接效率和連接特異性的影響；12U和30U的E.coliDNA連接酶用量對(duì)鎖式探針連接效率的差異；核酸外切酶Exonuclease I使用與否對(duì)RCA擴(kuò)增特異性的影響。 4. RCA擴(kuò)增檢測(cè)HBV的TDF耐藥突變位點(diǎn)：抽取25例臨床乙肝患者血清HBV的全基因組DNA，PCR方法擴(kuò)增TDF耐藥突變位點(diǎn)所在的HBV基因組RT區(qū)。PCR產(chǎn)物用RCA方法進(jìn)行TDF耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)，同時(shí)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果比較，驗(yàn)證檢測(cè)方法的準(zhǔn)確率及可行性。并用不同濃度的HBV野生型和突變型人工合成序列為模板，探討RCA方法的最低檢測(cè)限和檢測(cè)特異性。 5.建立雙循環(huán)RCA技術(shù)：第一輪RCA擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶HpaI酶切成PLP探針長(zhǎng)度的核苷酸片段，以酶切產(chǎn)物為模板，啟動(dòng)新一輪RCA擴(kuò)增反應(yīng)，建立雙循環(huán)RCA技術(shù)。以不同濃度的HBV野生型和突變型人工合成序列為模板，探討雙循環(huán)RCA方法的最低檢測(cè)限和檢測(cè)特異性。 結(jié)果: 1. Clustal X2軟件比對(duì)結(jié)果顯示，HBVTDF耐藥位點(diǎn)所在區(qū)域基因序列基因最為保守，適合設(shè)計(jì)padlock探針。針對(duì)TDF耐藥位點(diǎn)設(shè)計(jì)的PLP經(jīng)Primer Premier5.0預(yù)測(cè)，PLP及其引物無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)，環(huán)化連接后PLP的二級(jí)結(jié)構(gòu)也極少，保證了PLP與模板識(shí)別的高特異性和RCA擴(kuò)增的高效率。 2.以合成的TDF耐藥基因突變位點(diǎn)的HBV野生型和突變型序列為模板，建立RCA擴(kuò)增體系，RCA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，野生型序列有清晰的電泳條帶，突變型序列無(wú)RCA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶，表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的PLP探針能有效、特異識(shí)別TDF耐藥基因突變位點(diǎn)，可用于HBV耐藥基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)。 3.在PLP環(huán)化連接反應(yīng)中，PLP與HBV的DNA模板雜交溫度為45℃時(shí)，探針的環(huán)化連接效率最高、特異性最好；E.coli DNA連接酶用量為12U和30U時(shí)，其環(huán)化連接產(chǎn)量基本無(wú)顯著差異。從檢測(cè)成本考慮，連接酶用量為12U即可滿足實(shí)驗(yàn)需要。PLP環(huán)化連接產(chǎn)物不用核酸外切酶Exonuclease I消化，，突變型模板檢測(cè)可出現(xiàn)非特異性RCA擴(kuò)增產(chǎn)物，使用核酸外切酶能消化去除未連接成環(huán)的PLP，可有效提高檢測(cè)的特異性。 4.RCA法檢測(cè)25例乙肝患者HBV樣本，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，即均未發(fā)生TDF耐藥突變，與測(cè)序結(jié)果完全一致，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100%。RCA法檢測(cè)不同濃度的TDF耐藥基因野生型和突變型合成模板，RCA方法的最低檢測(cè)限為50pM，突變型模板檢測(cè)均無(wú)非特異性PLP連接產(chǎn)物及RCA擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)的特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差異。 5.用限制性核酸內(nèi)切酶HpaI酶切第一輪RCA擴(kuò)增產(chǎn)物，以酶切產(chǎn)物為模板，建立雙循環(huán)RCA擴(kuò)增技術(shù)，其檢測(cè)限為5pM，檢測(cè)靈敏度較單次RCA擴(kuò)增法提高10倍；雙循環(huán)RCA方法檢測(cè)突變型模板時(shí)，均未見(jiàn)RCA擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)特異性高。 結(jié)論： 1.設(shè)計(jì)了檢測(cè)HBV替諾福韋耐藥基因突變位點(diǎn)的鎖式探針，成功建立并優(yōu)化了RCA擴(kuò)增反應(yīng)體系，該方法檢測(cè)特異性強(qiáng)，檢測(cè)限較高，可應(yīng)用于HBV耐藥基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)。 2.建立的方法初步應(yīng)用于乙肝患者HBV替諾福韋耐藥基因突變位點(diǎn)的臨床檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果符合率高，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到100%，是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、成本低廉的HBV耐藥基因檢測(cè)新方法。 3.初步建立了雙循環(huán)RCA擴(kuò)增技術(shù)，成功將RCA檢測(cè)靈敏度提高了10倍，其檢測(cè)特異性強(qiáng)，檢測(cè)成本更加低廉，有望應(yīng)用于病原微生物耐藥基因的快速檢測(cè)。
[Abstract]:Background:
The data show that about 360 million people around the world are Hepatitis B virus (HBV) carriers. Persistent infection of HBV can lead to chronic hepatitis, liver cirrhosis and liver cancer. The use of nucleotide analogues (nucleotideanalogs; NAs) antiviral drugs is an effective method of anti HBV therapy at present. But due to the lack of correction work of HBV polymerase As a result, the frequency of gene mutation is high. Once the target gene of the drug is mutated, the NAs drug loses its inhibitory effect on the replication of the virus, thus producing the phenomenon of clinical resistance. At present, the methods of detection of HBV resistance genes include direct sequencing, real-time quantitative multi PCR, and gene chip, but the above methods are the following. Insufficient: (1) high requirement of instrument and equipment: not only need PCR, but also have DNA sequencer, gene chip reader and other expensive instruments, small medical institutions can not meet. 2. The detection time is long, the cost is high: the detection cycle is from hours to days, the time is long, the cost is high, the patient's economic burden is heavy. As a result, the establishment of a simple, fast, accurate and low cost HBV resistant gene detection technique is an important problem to be solved in the field of HBV prevention and control.
Padlock probe-Rolling circle amplification (PLP-RCA) is a new type of nucleic acid amplification technology developed in recent years..PLP is composed of two terminal identification sequences and intermediate connection sequences. When the two ends recognition sequence and target sequence are completely complementary hybridization, the terminal bases are adjacent to each other and under the action of the DNA ligase. Cyclized DNA molecules. Cyclized PLP can be used as a template for RCA amplification and RCA amplification reaction under the action of primers and polymerase. Compared with other nucleic acid amplification techniques, this technique has the unique advantages of high specificity, high sensitivity and simplicity of operation. Because PLP is only complementary to the target sequence at both ends. Therefore, the RCA amplification reaction can be initiated. Therefore, PLP has the ability to identify single base differences and has a unique advantage in the field of detection of resistance sites. In addition, RCA is constant temperature amplification, without expensive instruments and equipment, and can effectively reduce the detection cost. Therefore, PLP-RCA technology has the unique advantages of simple, rapid and accurate detection of HBV resistance gene.
Objective:
Based on PLP and RCA amplification, a new method for detecting mutation loci of HBV resistant gene in HBV is established by using HBV for the mutation site of Nuo Fuwei (TDF) resistance gene.
Method錛

本文編號(hào)：1807290