本文選題：人類免疫缺陷病毒 + 亞型��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2014年博士論文

【摘要】：人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）是獲得性免疫缺陷綜合征（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）的病原體，能夠引起以全身免疫系統(tǒng)嚴重損壞為特征的傳染性疾病，近30年來在全球肆虐流行，給人類的生命安全、經(jīng)濟發(fā)展和社會進步造成了十分嚴重的危害，已經(jīng)引起了各國政府和社會的普遍關注[1]。高效抗逆轉錄病毒療法（highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART）能夠有效地抑制HIV-1感染者體內病毒的復制，延長壽命并提高生活質量。然而HIV-1耐藥的出現(xiàn)極大地削弱了HAART的療效，并已成為抗病毒治療失敗的主要原因。HIV-1耐藥的產(chǎn)生是宿主、病毒和抗病毒藥物共同作用的結果。我國自2004年開展HIV耐藥研究以來，研究工作主要圍繞耐藥毒株發(fā)生和進化規(guī)律、耐藥毒株檢測方法等展開，尚未有我國人群遺傳因素與HIV-1耐藥關系的研究。本課題首先對我國部分地區(qū)接受抗病毒治療的艾滋病患者中HIV-1耐藥毒株流行的狀況進行了橫斷面研究，然后分析了我國流行的主要HIV-1毒株耐藥突變位點亞型間的分布差異，在掌握耐藥毒株流行狀況的基礎上，對我國HIV- 1感染人群體內參與抗病毒藥物吸收、分布、代謝及排泄（absorption,distribution,metabolism and excretion,ADME）的一系列酶和蛋白編碼基因的多態(tài)性情況及其與HIV-1耐藥發(fā)生的關系進行了系統(tǒng)、深入的研究，旨在為臨床制定延緩病毒耐藥產(chǎn)生的方法和策略、實現(xiàn)個體化治療、確保抗病毒治療效果及為實現(xiàn)我國有限的抗HIV藥物資源的長期、可持續(xù)應用奠定理論基礎。 第一部分：我國部分地區(qū)HIV-1感染者耐藥現(xiàn)狀研究 為了解和掌握我國接受抗病毒治療的艾滋病患者中HIV-1耐藥毒株的流行狀況，采用基于擴增測序的經(jīng)典HIV-1基因型耐藥檢測方法，對河北省、山西省及北京協(xié)和醫(yī)院收治的共322例艾滋病患者進行了基因型耐藥檢測，分析了人群耐藥情況及與耐藥發(fā)生相關的因素。主要結果如下： 1.322例艾滋病患者的耐藥率為46.5%，河北、山西及北京協(xié)和醫(yī)院患者的耐藥率分別為50.0%、56.5%和14.7%，地區(qū)差異顯著（Fisher’sexacttest,p0.05）。 2.不同地區(qū)樣本耐藥突變位點的分布無顯著性差異，常見耐藥突變位點均為M41L、D67N、K70R、K101E、K103N、Y181C、M184V、G190A、T215F及T215Y，其中K103N、Y181C和M184V分布頻率最高，分別為17.5%、12.9%和29.0%。 3.抗病毒藥物耐藥率依次為NVP46.2%、3TC32.8%、EFV30.1%、d4T20.7%、AZT12.2%、TDF5.9%，存在嚴重的交叉耐藥導致對一些未曾使用過的藥物耐藥，如ABC、RPV和ETR耐藥率分別達到33.2%、24.4%、22.6%。 4.統(tǒng)計學分析顯示HIV-1的感染途徑對耐藥程度具有顯著影響（性傳播：敏感55.4%、潛在耐藥5.0%、低度耐藥2.5%、中度耐藥1.7%、高度耐藥35.5%；血液傳播：敏感38.3%、潛在耐藥5.0%、高度耐藥56.7%，Kruskal-Wallistest,p0.05）；性別（男：D67N4.6%、Y181C9.3%、M184V23.2%、G190A7.3%，女：D67N1.7%、Y181C23.3%、M184V41.7%、G190A11.7%）和感染途徑（性傳播：M41L1.7%、K103N14.9%、Y181C8.3%、T215F/Y4.2%，血液傳播：M41L13.3%、K103N25.0%、Y181C20.0%、T215F/Y15.0%）對耐藥突變類型的影響具有統(tǒng)計學意義（Multinomial Logistic Regression, p0.05）。 第二部分：我國流行HIV-1毒株不同亞型間耐藥突變位點的差異分析 HIV-1具有高度的變異性，可分為M、N、O及P4個群，其中M群包含9個亞型、55個流行重組型（circulating recombinant form, CRF）以及難以計數(shù)的獨特重組型（uniquerecombinantform,URF），各個變異毒株的基礎基因序列不同，在藥物壓力下耐藥選擇和發(fā)生的路徑及難易程度也各不相同。目前幾乎所有抗病毒藥物的耐藥數(shù)據(jù)都是基于B亞型而獲得的，而我國流行的主要HIV-1毒株是CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亞型。為了解我國HIV-1主要流行毒株耐藥突變位點的分布差異，為優(yōu)化臨床治療方案、提高抗病毒治療效果提供指導，我們以5442條HIV-1pol區(qū)基因序列（按照來源分，本實驗室積累1483條、云南省艾滋病關愛中心提供335條、自HIV sequence database下載3624條；按照亞型分，CRF01_AE序列1696條、CRF07_BC序列502條、CRF08_BC序列924條和B亞型序列1984條）作為研究對象，分析了HIV-1不同亞型間pol區(qū)基因耐藥突變位點的氨基酸分布差異及其原因。主要結果如下： 1.不同亞型病毒間逆轉錄酶（RT）區(qū)19個耐藥突變位點的氨基酸分布存在顯著差異（chi-square test, p0.05），發(fā)生頻率占前5位的突變分別是：B亞型毒株，103、215、181、184、190；CRF01_AE，238、184、190、181、103；CRF08_BC，184、103、69、181、101/190。蛋白酶（PR）區(qū)17個耐藥突變位點的氨基酸分布存在顯著差異，發(fā)生頻率占前5位的突變分別是：B亞型毒株，89、63、77、93、35；CRF01_AE，89、36、35、93、63； CRF07_BC，63、89、93、35、77；CRF08_BC，93、36、63、89、82。 2. B亞型、CRF01_AE和CRF08_BC毒株逆轉錄酶（RT）區(qū)5個耐藥突變位點（69、138、181、215和238）的氨基酸由野生型轉變?yōu)槟退幮退韬塑账嵬蛔兊姆N類和數(shù)量即基因屏障存在顯著差異（Kruskal-Wallistest,p0.05），提示亞型對耐藥突變的產(chǎn)生具有一定的影響。 3.大部分耐藥突變位點是在各亞型序列多態(tài)性位點的基礎上發(fā)生的，多態(tài)性位點在抗病毒藥物的選擇下易發(fā)生耐藥突變。 4.不同亞型病毒中分布頻率最高的耐藥突變位點（20%）均為K103、Y181和M184，偏嗜耐藥突變位點（10%）基本一致，且B亞型毒株中的耐藥突變均存在于其他非B亞型毒株中。 5.目前人群水平上HIV-1不同亞型病毒的治療方案及耐藥突變位點的偏嗜情況基本一致，因此推斷針對B亞型設計的抗病毒藥物及治療方案同樣適用于包括CRF01_AE、CRF07_BC及CRF08_BC等在內的其他非B亞型病毒。 第三部分：宿主基因多態(tài)性與HIV-1耐藥的相關性研究 HIV-1耐藥是病毒、宿主和抗病毒藥物共同作用的結果。宿主參與抗HIV藥物吸收、分布、代謝及排泄的一系列酶或蛋白編碼基因上的單核苷酸多態(tài)性位點（singlenucleotidepolymorphismsite,SNPs），能夠影響抗HIV藥物的藥代動力學和/或藥效學，進而影響血漿藥物濃度及藥物選擇壓力，導致不能形成和/或維持對病毒的有效抑制，從而出現(xiàn)耐藥。分析并闡明宿主基因多態(tài)性與HIV-1耐藥的關系，可以為臨床上延緩HIV-1耐藥的發(fā)生、優(yōu)化抗病毒治療方案乃至個體化治療提供理論依據(jù)和技術支持。目前，國外相關研究大多集中或者局限于藥物藥代動力學和/或藥效學的改變，且多為單一基因或針對單一藥物的研究，，未見宿主基因多態(tài)性與HIV-1耐藥相關性的研究報道。在本研究中，首先采用PCR擴增和測序的方法檢測了與常用抗病毒藥物代謝密切相關的CYP（2B6、2C9及3A4）基因的SNPs在129例艾滋病患者體內的存在、分布情況，并對其與HIV-1耐藥的關系進行了分析；其次建立了檢測人體47個參與抗HIV藥物吸收、分布、代謝及排泄的一系列酶或蛋白編碼基因上SNPs的MassARRAY方法，然后檢測了這些SNPs在810例具有良好服藥依從性的艾滋病患者（北京協(xié)和醫(yī)院475例、云南省艾滋病關愛中心335例）中的分布情況，并測定了153例艾滋病患者NVP的血漿藥物濃度，結合臨床資料，對這些SNPs與HIV-1耐藥發(fā)生的相關性進行了深入分析。主要研究結果如下： 1.成功構建了CYP（2B6、2C9及3A4）基因外顯子區(qū)域及外顯子-內含子結合部SNPs的檢測方法，共檢測SNPs70個，其中分布頻率5%的SNPs17個，大部分位點為NCBISNPdb或Hapmap所收錄且分布于內含子區(qū)域，CYP2C9g.10417和CYP3A4g.20446為新鑒定多態(tài)性位點。 2.通過文獻閱讀、資料分析，結合我國使用的抗HIV藥物，確定了47個人體參與抗HIV藥物吸收、分布、代謝及排泄的酶或蛋白編碼基因上的SNPs，主要集中在細胞色素P450基因和ABC家族基因上。 3.設計了141條引物（47對擴增引物，47條延伸引物），建立并優(yōu)化了檢測47個SNPs等位基因堿基類型的MassARRAY方法，完成了810例接受抗病毒治療的艾滋病患者標本（敏感標本600份vs.耐藥標本210份）的檢測，首次獲得了47個SNPs在我國HIV-1感染/艾滋病人群中分布的數(shù)據(jù)，rs3892097（0.012vs.0.106）、rs12248560（0.012vs.0.152）、rs2740574（0.002vs.0.202）及rs7439366（0.004vs.0.126）等4個位點的等位基因分布與國外研究結果存在較大差異。 4.單因素分析顯示rs8192726、rs3745274、rs2279343、rs4646437、rs776746、rs17222723、rs899494、rs2274407、rs2231142、rs2231137及rs9264942等11個SNPs在抗病毒治療敏感-耐藥人群間的等位基因分布存在顯著差異（Fisher’sexacttest,p0.05）；多因素分析顯示rs2779343、rs776746、rs9264942及基線病毒載量等因素與HIV-1耐藥的產(chǎn)生存在顯著相關性（BinaryLogisticanalysis,p0.05），其中rs2779343AG/GG、rs776746GG、rs9264942TT及基線高病毒載量為耐藥發(fā)生的危險因素，OR分別為3.536/4.283、2.141、1.316和3.038，值得深入研究。 5.完成153份標本的血漿藥物濃度的檢測，并分析了血漿藥物濃度與HIV-1耐藥的關系。 第四部分：宿主BST-2基因與HIV-1Vpu基因多態(tài)性的相關性研究宿主BST-2基因編碼的黏合素蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一種抗病毒蛋白，是人體細胞內天然免疫機制的重要組成部分，能夠有效地抑制體內HIV-1Vpu缺陷病毒的復制。Vpu蛋白是HIV-1克服黏合素抗病毒作用的關鍵蛋白，能夠有效對抗黏合素蛋白的抗病毒作用，保證HIV-1復制的正常進行。闡明BST-2基因多態(tài)性并分析其與HIV-1Vpu基因多態(tài)性間的關系，有助于深入理解HIV-1的致病機制。 主要研究結果如下： 1.建立了宿主BST-2基因多態(tài)性的檢測方法，檢測到13個高頻SNPs，其中9個為NCBI SNPdb或Hapmap所收錄，4個為新鑒定位點，并對這些SNPs的分布及連鎖情況進行了分析。 2.建立了檢測上述13個SNPs等位基因的MassARRAY方法，并完成810例樣本的檢測。 3.建立了HIV-1Vpu基因的擴增方法，成功獲得413條序列，分析顯示不同亞型間Vpu基因氨基酸分布存在較大差異，且60%以上位點為多態(tài)性位點。 4. BST-2基因多態(tài)性對HIV-1Vpu基因的多態(tài)性情況具有顯著影響（Fisher’sexacttest,p0.05）；HIV-1Vpu基因多態(tài)性與病毒載量顯著相關（spearman’srho test, p0.05），與Vpu蛋白促進病毒顆粒釋放的功能相吻合。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R512.91

【參考文獻】

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1 陳冬;吳登俊;;單核苷酸多態(tài)性檢測方法的研究進展[J];生物技術通報;2008年02期

2 王璐;秦倩倩;丁正偉;李培龍;黑發(fā)欣;王麗艷;陳方方;;2010年中國艾滋病疫情網(wǎng)絡直報現(xiàn)狀與分析[J];中國艾滋病性病;2011年03期

本文編號：1772136