本文選題：HIV-1　切入點(diǎn)：ISG15　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：ISG15(Interferon-Stimulated Gene15, ISG15)是由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類泛素樣蛋白分子,大小為15KD,成熟的ISG15蛋白包含兩個(gè)泛素樣結(jié)構(gòu)域。ISG15能與靶蛋白分子通過(guò)共價(jià)結(jié)合發(fā)揮修飾作用,這一過(guò)程稱為ISG化(ISGylation)。ISG化過(guò)程與泛素化類似,是由多種酶催化的級(jí)聯(lián)反應(yīng),該反應(yīng)系統(tǒng)包括ISG15激活酶E1(UBE1L)、結(jié)合酶E2(UBCH8)、連接酶E3(HERC5)和ISG15特異性蛋白酶USP18。由于ISG15及其修飾酶系統(tǒng)在病毒感染或干擾素(Interferon,IFN)刺激后大量誘導(dǎo)表達(dá),因此ISG15介導(dǎo)的ISG化為干擾素介導(dǎo)抗病毒作用的重要途徑之一。 HIV-1子代病毒的組裝出芽、成熟以及感染性顆粒的形成均需要泛素化的輔助。研究表明HIV-1病毒感染后通過(guò)干擾素途徑上調(diào)ISG15蛋白,后者介導(dǎo)的ISG化能競(jìng)爭(zhēng)性抑制Gag蛋白的泛素化來(lái)干擾其復(fù)制,因此ISG15介導(dǎo)的泛素化修飾過(guò)程可能是其抗病毒效應(yīng)通路之一。而早期研究發(fā)現(xiàn)ISG15和HIV-1的Gag蛋白沒有直接相互作用,目前為止尚無(wú)ISG15和HIV-1其他蛋白直接相互作用的相關(guān)報(bào)道。另少量研究顯示ISG15能通過(guò)阻斷Gag蛋白組裝出芽過(guò)程而抑制HIV-1病毒的有效釋放,推測(cè)其機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)必須復(fù)合體(Endosomal Sorting Complex Required for Transport, ESCRT)成分的ISG化修飾而實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)HIV-1慢性感染者隊(duì)列連續(xù)多年的觀測(cè)結(jié)果顯示,ISG15與HIV/AIDS疾病進(jìn)展密切相關(guān)。HIV-1的感染能調(diào)節(jié)胞內(nèi)限制因子的表達(dá)；而胞內(nèi)限制因子的作用可能直接影響HIV-1感染宿主的后果(感染成功與否、典型進(jìn)展和慢性進(jìn)展等),其中達(dá)到一個(gè)平衡。但是對(duì)ISG15在HIV-1感染過(guò)程中的功能、作用方式以及可能存在的機(jī)制仍然知之甚少。值得慶幸的是,目前HIV-1似乎并未發(fā)展出拮抗ISG15抑制效應(yīng)的相應(yīng)機(jī)制,這一點(diǎn)提示ISG15用于抗HIV-1治療極具潛力。因此HIV-1感染情況下ISG15在不同細(xì)胞亞群中的表達(dá)情況及相應(yīng)的應(yīng)答通路的研究顯得尤為重要。 本研究首先利用體外細(xì)胞系感染模型,分別檢測(cè)HIV-1感染的細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄和翻譯水平ISG15的表達(dá)及細(xì)胞上清中p24蛋白水平,探討了HIV-1感染對(duì)ISG15表達(dá)的影響及后者對(duì)前者的抑制效應(yīng)。在6種HIV-1易感細(xì)胞系中,以IFN-a2b刺激作為陽(yáng)性對(duì)照,利用HIV-1感染性克隆pNL4-3轉(zhuǎn)染293T、TZM-bl和Hela細(xì)胞；HIV-1假病毒感染Jurkat、MT-4和THP-1細(xì)胞,通過(guò)熒光定量PCR(qPCR)和Western-Blot的方法分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測(cè)了ISG15的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)HIV-1感染或pNL4-3轉(zhuǎn)染后ISG15轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào),且在THP-1和TZM-bl細(xì)胞中尤為顯著。但除了TZM-bl細(xì)胞,其他5種細(xì)胞系中沒有表現(xiàn)出ISG15蛋白水平的上調(diào)。進(jìn)一步構(gòu)建ISG15真核表達(dá)質(zhì)粒,與HIV-1感染性克隆pNL4-3共轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示,293T細(xì)胞中ISG15能抑制HIV-1病毒顆粒的產(chǎn)生和成熟,并且這種抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴性；TZM-bl中雖然也有顯著的抑制作用,但是趨勢(shì)不同。HIV-1感染明顯上調(diào)ISG15轉(zhuǎn)錄但卻無(wú)ISG15蛋白產(chǎn)生,提示該病毒能對(duì)抗固有免疫活化及效應(yīng)。 體外細(xì)胞模型的研究結(jié)果需要在HIV-1感染者隊(duì)列中加以驗(yàn)證才具有意義,并最終提示ISG15的臨床應(yīng)用前景。因此,本研究以HIV-1慢性感染者隊(duì)列為研究對(duì)象,以健康志愿者作為對(duì)照,采集血樣,分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs),分別在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測(cè)了不同進(jìn)展期病人不同細(xì)胞亞群中ISG15的表達(dá)情況。對(duì)健康人、HIV-1感染治療者(ART+)、感染未治療的慢性進(jìn)展者(SP)和典型進(jìn)展者(TP)中ISG15表達(dá)情況進(jìn)行了系統(tǒng)的描述、分析了病人PBMCs對(duì)IFN刺激的響應(yīng)性以及ISG15表達(dá)和疾病進(jìn)展的相關(guān)性。結(jié)果顯示,HIV-1慢性感染者PBMCs中ISG15轉(zhuǎn)錄水平較高,而在蛋白水平HIV-1慢性感染者和健康志愿者之間沒有顯著差異；但是HIV-1慢性感染者的PBMCs對(duì)IFN刺激的響應(yīng)性顯著下降。不同細(xì)胞亞群的分析顯示單核細(xì)胞中ISG15的表達(dá)量最高,提示單核細(xì)胞可能是ISG15介導(dǎo)抗HIV-1作用的關(guān)鍵細(xì)胞亞群。相關(guān)性分析顯示HIV-1慢性感染者PBMCs中轉(zhuǎn)錄水平ISG15的表達(dá)和病毒載量以及CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)之間存在一定的相關(guān)性。總之,本研究對(duì)HIV-1慢性感染者中ISG15的表達(dá)情況進(jìn)行了系統(tǒng)的描述,同時(shí)發(fā)現(xiàn)ISG15的表達(dá)和HIV-1疾病進(jìn)展相關(guān),為HIV-1感染的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)和新思路。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.91

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王仁剛;KAUL Marcus;張東賢;;干擾素激活基因15作為一種急性和慢性神經(jīng)損傷的通用標(biāo)記(英文)[J];生理學(xué)報(bào);2012年05期

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本文編號(hào)：1639858