本文選題：HCV　切入點：core　出處：《河北醫(yī)科大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：越來越多研究表明，嗜肝性丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是導致慢性化肝炎、乃至原發(fā)性肝癌的主要病原體，HCV不僅可以感染肝細胞，在很多免疫細胞（如B細胞、T細胞、單核巨噬細胞）內(nèi)也可檢測到HCV的復制，且HCV的病毒蛋白可與寄宿細胞內(nèi)、外的相應蛋白或受體結(jié)合，影響該細胞的生物學活性：如非結(jié)構(gòu)蛋白NS3可通過封閉TLR3途徑抑制固有免疫應答或通過活化TLR2受體途徑促進固有免疫應答發(fā)生；胞膜蛋白E2與NK細胞表面受體CD81結(jié)合抑制NK細胞功能等。提示在HCV感染宿主過程中，與宿主免疫細胞可能通過多種途徑相互作用，而HCV、免疫細胞、肝細胞三者的相互影響，既有可能促使HCV的清除，也有可能有利于HCV的免疫逃逸，導致慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌（HCC）的發(fā)生。 HCV核心蛋白（HCV core）作為HCV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒核衣殼的組成部分，除參與病毒的組裝，還會影響著宿主細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導、物質(zhì)代謝以及凋亡等一系列生化過程：如轉(zhuǎn)染HCV core的HepG2可通過自分泌TGF-α，引起細胞內(nèi)MAPK/ERK通路活化，，最終導致HepG2的增殖加快；HCV core還可抑制抑癌基因p53啟動子的活性，參與HCC的發(fā)生。庫否氏細胞是定居于肝臟內(nèi)的一類重要的巨噬細胞，約占肝臟細胞總數(shù)的15%～20%，發(fā)揮重要的免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)作用。然而在HCV持續(xù)感染時，表達HCV core蛋白的受體C1qR的單核細胞可被募集到肝臟組織，在肝臟炎性微環(huán)境中分化為不同亞型的巨噬細胞，包括經(jīng)典激活的巨噬細胞M1、替代途徑激活的巨噬細胞M2、腫瘤相關巨噬細胞、髓系來源的抑制細胞等，這些不同亞型巨噬細胞可分泌不同的細胞因子，在病毒的感染與腫瘤的形成及擴散中發(fā)揮不同的作用。換言之，在HCV的慢性感染過程中，HCV core蛋白與巨噬細胞表面受體C1qR結(jié)合導致巨噬細胞發(fā)生了哪些生物學變化，這些變化與HCV所致的疾病的進程有哪些關系，以及在肝臟微環(huán)境中肝細胞與巨噬細胞之間是如何互相制約，互相協(xié)調(diào)都不十分清楚。 本研究旨在了解在HCV core蛋白作用下的巨噬細胞與不同的人肝細胞株相互作用后，肝細胞和巨噬細胞發(fā)生的變化，以期探討巨噬細胞在HCV導致的HCC中所充當?shù)慕巧�，為HCV的慢性化機制的研究和免疫治療提供新的視角。因此，采用了以下實驗策略：1、應用原核表達系統(tǒng)獲得HCV core蛋白，作用巨噬細胞后，分別收集細胞培養(yǎng)上清及巨噬細胞與不同人肝細胞株（L02、HepG2）相互作用，研究HCV core蛋白作用后的巨噬細胞與肝細胞增殖的關系；2、在了解HCV作用下的巨噬細胞培養(yǎng)上清可以促肝細胞增殖的前提下，用Transwell小室培養(yǎng)系統(tǒng)（非直接接觸）共培養(yǎng)HCV core蛋白、巨噬細胞及人肝細胞株（L02、HepG2），通過肝細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子表達的變化，深入研究相關機制；3、根據(jù)以上實驗結(jié)果，通過RT-PCR、ELISA、Western blot、流式細胞術等手段了解巨噬細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、炎性細胞因子以及細胞膜分子的變化以深入揭示HCV core蛋白以及肝細胞代謝對巨噬細胞的作用。 方法： 1PCR方法從JFH-1株(HCV2a)全長基因質(zhì)粒上擴增HCV core基因,克隆至pMD18-T載體并測序，后經(jīng)BamHI和HindⅢ雙酶切，將其克隆至原核表達質(zhì)粒pET-28a構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET-28a/HCV core，通過IPTG誘導獲得高效表達目的蛋白的包涵體，經(jīng)純化和復性、LPS定量檢測后，行SDS-PAGE和Western blot鑒定。 2PMA誘導人單核細胞株Thp1分化為巨噬細胞PMA-Thp1，以RT-PCR檢測HCV core蛋白作用后細胞表面受體C1qR mRNA表達水平，驗證原核表達蛋白HCV core的生物學活性，同時設PBS、LPS作用PMA-Thp1作為對照；使用不同濃度HCV core蛋白作用PMA-Thp1，確定HCV core蛋白作用最適濃度。 3HCV core蛋白作用PMA-Thp1后收集細胞培養(yǎng)上清，以不同濃度（10%細胞培養(yǎng)上清+90%完全培養(yǎng)基、20%細胞培養(yǎng)上清+80%完全培養(yǎng)基、40%細胞培養(yǎng)上清+60%完全培養(yǎng)基）分別與人肝細胞株L02、HepG2共培養(yǎng)，CCK8法檢測培養(yǎng)不同時間點（24h、48h、72h）肝細胞增殖的動態(tài)變化，同時設PBS作用的PMA-Thp1細胞培養(yǎng)上清或僅含有HCVcore蛋白的完全培養(yǎng)基作用的肝細胞組作為陰性對照和蛋白對照。 4HCV core蛋白作用PMA-Thp124h后收集PMA-Thp1細胞，經(jīng)絲裂霉素處理后分別與人肝細胞株L02、HepG2共培養(yǎng)（肝細胞與PMA-Thp1細胞數(shù)比值分別為25:1、50:1），CCK8法檢測培養(yǎng)不同時間點（24h、48h、72h）肝細胞增殖的動態(tài)變化，同時以PBS作用的PMA-Thp1細胞或僅含完全培養(yǎng)作用的肝細胞組作為陰性對照和陽性對照。 5用Transwell小室培養(yǎng)系統(tǒng)將HCV core蛋白作用的PMA-Thp1細胞分別與人肝細胞株L02、HepG2（非直接接觸）共培養(yǎng)24h，行Westernblot檢測肝細胞內(nèi)MAPK通路相關蛋白（ERK、JNK、p38）的活性，同時設PBS作用PMA-Thp1共培養(yǎng)的肝細胞組、HCV core單獨作用的肝細胞組及肝細胞組作為對照。 6HCV core蛋白作用PMA-Thp1后，RT-PCR檢測PMA-Thp1細胞促炎和抗炎因子（IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-8、TGF-β）mRNA水平變化；ELISA檢測PMA-Thp1細胞培養(yǎng)上清抗炎因子TGF-β的表達變化；流式細胞術檢測PMA-Thp1細胞膜表面與M1、M2巨噬細胞表型有關分子（CD14、CD16、CD206、CD86）表達變化，同時設PBS、LPS、LPS+HCVcore作用的PMA-Thp1組作為對照；Western blot檢測HCV core蛋白、肝細胞共同作用的PMA-Thp1細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB、STAT3、STAT1）的活性。 結(jié)果： 1成功構(gòu)建了pET28a/HCVcore原核表達質(zhì)粒，并得以表達。經(jīng)鱟試劑檢測表達蛋白中LPS含量為0.9EU/ml。SDS-PAGE電泳和Western blot結(jié)果顯示，純化后獲得分子量約為21KD的單一條帶，可與鼠抗人HCVcore單克隆抗體特異性雜交。 2經(jīng)細胞形態(tài)學觀察和流式細胞術檢測細胞表面分子（CD11b、CD11c），結(jié)果顯示，以40ng/ml佛波酯（PMA）作用Thp148h后，細胞形態(tài)發(fā)生改變，巨噬細胞特異的細胞表面分子CD11b、CD11cmRNA水平顯著升高（P0.05）。 3Real-time PCR結(jié)果顯示： HCV core蛋白作用PMA-Thp16h、12h后其受體C1qR mRNA水平顯著高于對照組（P0.05）；并確定HCV core作用PMA-Thp1最適濃度為10μg/ml。 4細胞增殖曲線顯示HCV core蛋白作用PMA-Thp1收集細胞培養(yǎng)上清對L02細胞增殖的影響：與陰性對照組相比，不同濃度細胞培養(yǎng)上清均使L02細胞增殖加快；與陰性對照和蛋白對照組相比，20%細胞培養(yǎng)上清使L02增殖顯著（P0.05）。 5細胞增殖曲線顯示HCV core蛋白作用PMA-Thp1收集細胞培養(yǎng)上清對HepG2細胞增殖的影響：10%細胞培養(yǎng)上清作用的HepG2在24h、48h、72h時間點生長均大于陰性對照和蛋白對照組，其中48h、72h時間點差別顯著（P0.05），20%上清組和40%上清組對HepG2增殖作用不明顯。 6HCV core蛋白作用PMA-Thp1后收集的細胞經(jīng)絲裂霉素固定后與肝細胞共培養(yǎng)，與對照組相比，無明顯促肝細胞增殖作用，說明巨噬細胞膜分子對肝細胞增殖作用無影響。 7Western blot顯示HCV core蛋白作用PMA-Thp1與人肝細胞株共培養(yǎng)后，與對照組比較，L02細胞內(nèi)磷酸化的ERK表達明顯升高，但磷酸化的JNK和p38表達沒有改變；而HepG2細胞內(nèi)只有磷酸化的JNK表達明顯升高。 8HCV core蛋白作用PMA-Thp1不同時間后，（1） RT-PCR結(jié)果顯示：細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-8、TGF-βmRNA水平與PBS對照組比較均有明顯改變（P0.05）；（2）ELISA結(jié)果顯示：細胞培養(yǎng)上清中TGF-β的表達明顯高于對照組（P0.05），含量為168pg/ml；（3）流式細胞術檢測結(jié)果顯示：細胞膜表面分子CD14、CD16、CD206的表達與其他三組均無區(qū)別，CD86表達與PBS作用組相同；（4）Western blot結(jié)果顯示：與PBS對照組相比，磷酸化的NF-κB65和NF-κB105表達在1h和4h升高，磷酸化的STAT1和STATR3表達無明顯動態(tài)改變。 9HCV core蛋白、肝細胞、巨噬細胞三者相互作用致與巨噬細胞分化有關的轉(zhuǎn)錄因子的表達和活化：（1）與core蛋白、L02細胞共培養(yǎng)的巨噬細胞磷酸化的STAT3的表達明顯增加，而與core蛋白、HepG2共培養(yǎng)的巨噬細胞的磷酸化STAT3的表達則無明顯改變；（2）與L02細胞、巨噬細胞共培養(yǎng)的對照組相比，L02、巨噬細胞、core蛋白三者共培養(yǎng)致磷酸化的STAT3表達升高的同時，磷酸化的STAT1表達為降低狀態(tài)。 結(jié)論： 1成功構(gòu)建、表達了具有生物學活性的HCV core蛋白。 2HCV core蛋白作用PMA-Thp1巨噬細胞后的細胞上清有促進肝細胞株L02、HepG2增殖的作用，可能與巨噬細胞分泌的可溶性因子有關，而與巨噬細胞表面分子以及HCV core蛋白直接作用無關。 3HCV core蛋白作用PMA-Thp1后促進肝細胞的增殖，在L02細胞可能與上調(diào)磷酸化的ERK表達相關，反之，L02細胞、core蛋白、巨噬細胞三者共培養(yǎng)可上調(diào)巨噬細胞內(nèi)磷酸化STAT3的含量。而對HepG2細胞的影響僅表現(xiàn)為磷酸化的JNK含量上調(diào)，HepG2對巨噬細胞的影響作用不明顯。 4HCV core蛋白作用PMA-Thp1可致細胞轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子表達發(fā)生動態(tài)改變，但與不同肝細胞相互作用后的結(jié)果不完全相同，提示與不同特性肝細胞的相互作用可影響巨噬細胞的生物學功能。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.63

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本文編號：1640389