本文關(guān)鍵詞： 煙曲霉 絲切蛋白 極性生長(zhǎng) 應(yīng)激敏感性 毒力　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：煙曲霉是臨床重要條件性致病絲狀真菌之一,是引發(fā)人類曲霉病的主要菌種。煙曲霉主要感染免疫缺陷人群,其引起的侵襲性曲霉病有很高的死亡率,可達(dá)80-95%。近年來(lái)由于介入治療增多和免疫抑制劑的廣泛使用,免疫缺陷人群的數(shù)量在不斷增加,而另一方面不同國(guó)家和地區(qū)關(guān)于煙曲霉對(duì)目前臨床抗真菌治療的一線藥物,三唑類抗真菌藥物,包括伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑等的耐藥的報(bào)道,甚至是多重耐藥的報(bào)道在不斷增多,因此發(fā)現(xiàn)新的抗真菌治療靶點(diǎn)和解析煙曲霉耐藥機(jī)制成為應(yīng)對(duì)煙曲霉感染的研究熱點(diǎn)。煙曲霉毒力是由多因素控制的,包括細(xì)胞壁組成成分、毒素、過(guò)敏原和蛋白酶等,宿主則通過(guò)第一道防線,固有免疫,吞噬和釋放炎性因子等抑制或清除煙曲霉。其中抵抗外界應(yīng)激和逃避宿主免疫的能力是影響煙曲霉毒力的關(guān)鍵因素。肌動(dòng)蛋白骨架在真菌細(xì)胞極性生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、應(yīng)激和維持細(xì)胞形態(tài)等方面發(fā)揮重要作用,調(diào)控其功能的蛋白網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜,許多結(jié)合因子的功能亟待闡明。Cofilin(絲切蛋白)是一種肌動(dòng)蛋白解聚因子,是肌動(dòng)蛋白骨架重排的調(diào)控核心之一。其可切割肌動(dòng)蛋白纖絲,當(dāng)其N末端絲氨酸被磷酸化時(shí),便失去切割活性。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,Cofilin參與許多生理功能,包括細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、胞質(zhì)分裂、胞吞胞吐等。在釀酒酵母中,Cofilin是必需蛋白,其點(diǎn)突變影響菌株的生長(zhǎng)表型和多重耐藥。而煙曲霉Cofilin的功能尚不清楚。因此,本論文的研究目的就是闡明Cofilin在煙曲霉不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)及其分布規(guī)律,并通過(guò)改變Cofilin蛋白的表達(dá)量、磷酸化狀態(tài)以及突變關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)探究了Cofilin在煙曲霉生長(zhǎng)、胞外應(yīng)激和毒力中的作用,最終通過(guò)這些系統(tǒng)性的研究,為抗真菌治療提供新的理論依據(jù)或可能的新靶點(diǎn)。首先,我們通過(guò)RT-qPCR方法確定了Cofilin在煙曲霉萌發(fā)階段(生長(zhǎng)8 h時(shí))表達(dá)最多。借助于熒光顯微鏡,我們對(duì)Cofilin蛋白融合GFP的菌株進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)Cofilin蛋白彌漫的分布于胞質(zhì)中。根據(jù)同源重組原理和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法,我們構(gòu)建了以CEA17ku80Δ菌株為親本的cofilin條件性敲除株(cofilinteton)、過(guò)表達(dá)株(cofilin OE)、cofilinS5A突變株和以cofilinteton為親本的cofilinS5E突變株(cofilinteton/cofilinS5E)。cofilinteton在低濃度多西環(huán)素(3?g/ml)存在時(shí)Cofilin的表達(dá)明顯低于親本菌株;而cofilin OE中的Cofilin表達(dá)量始終高于親本菌株。CofilinS5A突變后,Cofilin不能被磷酸化,模擬持續(xù)的激活狀態(tài);CofilinS5E突變后,模擬Cofilin持續(xù)性磷酸化狀態(tài)。通過(guò)菌株生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)Cofilin是煙曲霉的必需蛋白。Cofilin低表達(dá)導(dǎo)致煙曲霉在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率明顯下降,菌絲的極性生長(zhǎng)受到嚴(yán)重?fù)p害,菌落輻射狀生長(zhǎng)消失;在液體培養(yǎng)基中cofilinteton生長(zhǎng)初期常形成章魚樣結(jié)構(gòu),菌絲分支增多,而且出現(xiàn)胞質(zhì)泄露,而這種生長(zhǎng)抑制很可能是胞質(zhì)泄露引起的,因?yàn)橥庠醇尤肷嚼娲伎伞罢取眂ofilinteton的生長(zhǎng)。Cofilin過(guò)表達(dá)對(duì)煙曲霉形態(tài)幾乎無(wú)影響,但在MM固體培養(yǎng)基,28°C培養(yǎng)時(shí)cofilin OE的生長(zhǎng)速率會(huì)明顯高于親本菌株。煙曲霉在不同胞外應(yīng)激條件的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示,cofilinteton對(duì)熒光白、法尼醇、剛果紅敏感性與親本菌株相比無(wú)顯著差異,對(duì)SDS、H2O2和堿性pH9.0敏感性則顯著高于親本菌株;cofilin OE除了對(duì)H2O2的敏感性減弱之外,對(duì)其他應(yīng)激的敏感性與親本菌株基本無(wú)差異。進(jìn)而,我們發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激基因(catA、cat1、skn7、yap1)和堿性pH的基因pacC在cofilinteton中表達(dá)下調(diào),在cofilin OE中表達(dá)上調(diào)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot),我們還發(fā)現(xiàn)Cofilin過(guò)表達(dá)激活了高滲透壓甘油應(yīng)激通路,pSakA表達(dá)增多,同時(shí)SakA激活的3個(gè)標(biāo)記基因catA、dprA和dprB的mRNA表達(dá)也增多。通過(guò)體內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)cofilinteton感染的大蠟螟生存率顯著高于親本菌株,然而cofilin OE感染的大蠟螟和免疫缺陷小鼠(氫化可的松模型和環(huán)磷酰胺模型)的生存率與親本菌株感染的生存率無(wú)顯著差別,這提示Cofilin可能參與煙曲霉毒力的調(diào)節(jié)。接下來(lái),我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究了Cofilin表達(dá)改變對(duì)煙曲霉與宿主細(xì)胞相互作用的影響,結(jié)果顯示cofilinteton和cofilin OE對(duì)肺上皮細(xì)胞A549的粘附能力都減弱,Cofilin低表達(dá)會(huì)引起煙曲霉粘附相關(guān)因子medA、stuA和uge3的下調(diào),而Cofilin過(guò)表達(dá)僅引起stuA的下調(diào)。進(jìn)而,采用制霉菌素保護(hù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定兩種菌株及親本菌株對(duì)肺上皮細(xì)胞A549細(xì)胞的侵染能力(即在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活能力)發(fā)現(xiàn),Cofilin低表達(dá)使煙曲霉侵染A549細(xì)胞能力減弱,而Cofilin過(guò)表達(dá)使煙曲霉侵染A549細(xì)胞能力增強(qiáng)。再用3種菌株及它們的培養(yǎng)上清分別刺激A549細(xì)胞,通過(guò)RT-qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞炎性因子MCP-1、IL-8和TNF-α表達(dá)水平,結(jié)果顯示:cofilinteton刺激時(shí),A549細(xì)胞MCP-1表達(dá)減少;cofilin OE刺激時(shí),A549細(xì)胞MCP-1表達(dá)增多;但它們的培養(yǎng)上清刺激時(shí),A549細(xì)胞MCP-1表達(dá)無(wú)變化。這說(shuō)明Cofilin以某種方式影響了宿主細(xì)胞炎癥因子的釋放,而這種表達(dá)的改變可能與菌株表面的成分發(fā)生變化有關(guān),而與菌株外分泌的物質(zhì)關(guān)系不大。cofilin OE和親本菌株分別刺激用抗dectin-1抗體封閉的A549細(xì)胞,兩組細(xì)胞表達(dá)MCP-1無(wú)顯著差別。進(jìn)一步,用免疫熒光方法標(biāo)記菌株表面多糖,發(fā)現(xiàn)cofilin OE表面β-1,3-glucan和多糖共軛物增多,而cofilinteton表面β-1,3-glucan和多糖共軛物減少。這些結(jié)果提示cofilin OE刺激A549細(xì)胞MCP-1表達(dá)增多可能依賴菌株表面β-1,3-glucan的增多。由此,我們進(jìn)一步用RT-qPCR方法對(duì)煙曲霉β-1,3-glucan合成酶和幾丁質(zhì)合成酶家族基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示cofilinteton的這些基因的確表達(dá)下調(diào),cofilin OE中的這些基因表達(dá)則上調(diào)。有趣的是,蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示Cofilin低表達(dá)顯著激活MpkA,使MpkA磷酸化顯著增多,而Cofilin過(guò)表達(dá)則不影響MpkA激活,這提示Cofilin的表達(dá)改變顯著影響了煙曲霉的極性生長(zhǎng)、氧化和堿性pH應(yīng)激以及毒力,這可能與Cofilin影響了煙曲霉胞壁多糖合成有關(guān),但這種Cofilin影響的煙曲霉胞壁多糖合成可能不依賴MpkA介導(dǎo)的細(xì)胞壁完整性信號(hào)通路的調(diào)控。緊接著,我們研究了Cofilin磷酸化狀態(tài)改變(S5A和S5E突變)對(duì)煙曲霉菌株的影響。首先,CofilinS5A突變對(duì)煙曲霉形態(tài)和生長(zhǎng)速率幾乎不影響;CofilinS5A突變后,煙曲霉對(duì)細(xì)胞壁干擾劑、H2O2和堿性pH的應(yīng)激敏感性無(wú)明顯變化;另外,cofilinS5A突變株與親本菌株對(duì)A549細(xì)胞的侵染能力和在氫化可的松免疫缺陷小鼠中的毒力都無(wú)顯著性差別。CofilinS5E突變會(huì)抑制菌株生長(zhǎng),如果Cofilin完全磷酸化,煙曲霉菌株無(wú)法存活;cofilinteton基礎(chǔ)上的CofilinS5E突變(cofilinteton/cofilinS5E)并沒有加重cofilinteton在應(yīng)激方面的表型。這提示Cofilin的磷酸化狀態(tài)對(duì)煙曲霉生存與生長(zhǎng)至關(guān)重要,過(guò)多非磷酸化Cofilin的存在對(duì)煙曲霉生理功能的影響可能不大,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究分析。最后,為了更加深入研究煙曲霉Cofilin的功能,我們將Cofilin的多個(gè)可能重要功能位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變,并提出一種通過(guò)構(gòu)建母版基因突變cassette來(lái)實(shí)現(xiàn)基因突變的新策略。該策略簡(jiǎn)單,不需要構(gòu)建質(zhì)粒,從而不需要酶切連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化和篩選,節(jié)省構(gòu)建時(shí)間,較適用于一次性構(gòu)建同一個(gè)基因多種突變菌株,而且是在基因組原位實(shí)現(xiàn)突變。通過(guò)該策略,我們構(gòu)建了3種cofilin突變株cofilinD21A,R21A,cofilinK36A和cofilinE48A,這些位點(diǎn)都是帶電荷的氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)cofilinD21A,R21A,cofilinK36A菌株與親本菌株比較,產(chǎn)孢減少,色素增多。用熒光白染色菌絲,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)cofilinK36A菌絲顯著膨脹。通過(guò)成株實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)cofilinD21A,R21A和cofilinK36A突變株對(duì)伏立康唑和伊曲康唑的敏感性顯著減弱,cofilinE48A突變株僅對(duì)伏立康唑的敏感性減弱。制霉菌素保護(hù)實(shí)驗(yàn)則顯示,3種cofilin突變株對(duì)A549細(xì)胞侵染能力都顯著低于親本菌株。但是,3種突變株對(duì)氫化可的松免疫缺陷小鼠的毒力與親本菌株比較無(wú)顯著差別。這三種突變株調(diào)節(jié)耐藥性及侵染能力的可能機(jī)制將在進(jìn)一步研究中闡明。綜上所述,本論文研究較為系統(tǒng)地分析闡明了Cofilin在煙曲霉極性生長(zhǎng)、抵抗應(yīng)激以及毒力等中的功能及可能的調(diào)控機(jī)制,在煙曲霉中發(fā)現(xiàn)了肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)蛋白與細(xì)胞壁應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制及毒力間的聯(lián)系;鑒于煙曲霉Cofilin與人同源蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),本研究也為抗真菌治療提供了新的理論依據(jù)和可能的藥物靶點(diǎn)。另外,我們的研究還建立了一種新的煙曲霉基因突變策略,為篩選煙曲霉重要蛋白的關(guān)鍵氨基酸和研究蛋白結(jié)構(gòu)與功能間關(guān)系提供了極大的方便。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R519

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊邦敏;姜浩;蘇琦;;Cofilin與腫瘤[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年03期

2 徐陽(yáng);原麗平;陳金鈴;黃曉紅;;肌動(dòng)蛋白解聚因子/cofilin功能的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2012年01期

3 劉崗;鐘武裝;肖麗萍;樂(lè)德;;肺癌患者血漿cofilin蛋白含量檢測(cè)在肺癌診斷中的應(yīng)用分析[J];臨床肺科雜志;2014年09期

4 吳勇軍;唐儀;蘇琦;;Cofilin與腫瘤的關(guān)系[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)工程;2011年01期

5 孟令杰;邢風(fēng)娟;王巖;;Cofilin在腫瘤中作用的研究進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué);2013年01期

6 閻力;;抑制血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的煙曲霉素的合成類似物[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));1991年04期

7 廖軍;鐘白玉;郝飛;;肺泡巨噬細(xì)胞體外抗煙曲霉孢子及其代謝產(chǎn)物的電鏡觀察[J];中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志;2009年04期

8 蔡亞玲;;煙曲霉中的血管生成抑制劑5-demethoxyfumagillol[J];國(guó)外醫(yī)藥(植物藥分冊(cè));2005年02期

9 王麗;;煙曲霉基因組與致病機(jī)制[J];中國(guó)真菌學(xué)雜志;2011年01期

10 興儉;蜂蜜引起的疾病[J];世界農(nóng)業(yè);1981年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前2條

1 黃洵;潘秋明;孫丹妮;陳奕;丁健;耿美玉;;硫酸寡糖JG6針對(duì)骨架蛋白Cofilin的作用機(jī)制研究[A];2011醫(yī)學(xué)科學(xué)前沿論壇第十二屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

2 胡新德;張偉;劉笙腩;李玲玲;宋玲珍;柴學(xué)軍;陳樹林;趙善廷;;小鼠海馬發(fā)育過(guò)程中Cofilin及其磷酸化狀態(tài)調(diào)節(jié)基因表達(dá)差異分析[A];中國(guó)神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)第十屆全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 閆秀寶;Cofilin信號(hào)通路在無(wú)骨折脫位型頸脊髓損傷中的作用研究[D];長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué);2011年

2 曹葳蕤;煙曲霉素在蜂蜜中的殘留變化規(guī)律研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

，

本文編號(hào)：1533255