本文關(guān)鍵詞： 恥垢分枝桿菌 動物模型 脂阿拉伯甘露聚糖 細胞因子　出處：《大連醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：結(jié)核�。═uberclosis）是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種嚴重的呼吸道傳染病。結(jié)核病引起的后果對社會來說是巨大的�，F(xiàn)在全世界三分之一的人口（約20億人）已經(jīng)感染了結(jié)核分枝桿菌，結(jié)核病占全球疾病的2.5%。盡管比起其他感染性疾病結(jié)核病的發(fā)病率有一個穩(wěn)固的下降，但是除非有重大的研究結(jié)果出現(xiàn)，結(jié)核病持續(xù)較高死亡率的情況將持續(xù)到2020年。艾滋病和其合并形成了一個致死性的疾病組合，互相能加速發(fā)病的進程。這樣的情況說明，結(jié)核病的發(fā)病與否與宿主的免疫系統(tǒng)有著非常密切的聯(lián)系，因此結(jié)核病也成為世界關(guān)心的健康問題。[1,2,3] 分枝桿菌屬包括大約100多種菌，其中包括能引起結(jié)核病的致病性分枝桿菌，如結(jié)核分枝桿菌；同樣還包括非致病性的分枝桿菌，如恥垢分枝桿菌。恥垢分枝桿菌是一種與結(jié)核分枝桿菌具有同源性、快速生長、少量接種對豚鼠、大鼠、小鼠無致病性的分枝桿菌[4,5]。其細胞壁表面的有效抗原成分，如脂阿拉伯甘露糖（LAM）、脂蛋白（LP）及全細胞溶解物（Whole Cell Lysate,WCL），是與宿主免疫系統(tǒng)互相作用的分子[8,9]，這些分子是安全、有效的免疫調(diào)節(jié)劑，能有效地促進免疫系統(tǒng)的Th1應(yīng)答[9]。 在闡明結(jié)核病發(fā)病機制、研發(fā)疫苗等實驗研究中，動物實驗是最有效和不可缺少的方法[13,17]。本實驗優(yōu)化了構(gòu)建恥垢分枝桿菌小鼠模型的方法，不但對小鼠的外部傷害減少的最低程度，同時也更真實地模擬了人類感染結(jié)核分枝桿菌的方式，以此來探討高濃度（5×107CFU/day）恥垢分枝桿菌構(gòu)建小鼠模型的可行性。 本實驗的目的： (1)本實驗利用高濃度（5×107CFU/day）的非致病性恥垢分枝桿菌構(gòu)建小鼠模型，以微生物氣溶膠氣霧攻擊方式使小鼠肺部產(chǎn)生類結(jié)核狀病變，來探討利用此種方法、此種條件下，建模的可行性； (2)探討高濃度（5×107CFU/day）的非致病性恥垢分枝桿菌在持續(xù)感染的情況下使小鼠肺部產(chǎn)生病理損傷的原因； (3)探討恥垢分枝桿菌細胞壁表面成分脂阿拉伯甘露糖（LAM）對小鼠免疫系統(tǒng)的刺激和調(diào)節(jié)作用； (4)探討恥垢分枝桿菌全細胞溶解物（WCL）對小鼠免疫系統(tǒng)的刺激和調(diào)節(jié)作用。 本實驗的主要方法： (1)選擇近交系動物中對分枝桿菌最敏感的的C57BL小鼠，周齡為4-8周的雄性小鼠； (2)利用加入0.05%的Tween80LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)野生型恥垢分枝桿菌M.Smegmatis mc2155菌株； (3)利用M.Smegmatis mc2155的生長曲線與OD589測定菌液的濃度； (4)提取野生型恥垢分枝桿菌M.Smegmatis mc2155細胞壁表面物質(zhì)脂阿拉伯甘露糖（LAM）； (5) M.smegmatis mc2155WCL（Whole Cell Lysate，全細胞溶解物）的制備：菌體細胞與細胞裂解液37℃孵育10min，菌液進行超聲破碎，功率200W，破碎30s，間歇30s；破碎20-30個循環(huán)； (6)將實驗動物C57BL小鼠隨機分成5組：空白組，S組，LS組， WS1組，WS2組。各組動物分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)條件保持恒溫恒濕，并定期通風消毒。 (7)小鼠的處理：各組小鼠按如下方式制備感染物，利用微生物氣溶膠發(fā)生器制備感染物的氣溶膠懸液，以氣霧攻擊方式感染小鼠。S組：5×107CFU野生型M.smegmatis MC2155；LS組：30μg/day LAM，預(yù)處理兩天，第三天開始5×107CFU野生型M.smegmatis MC2155處理；WS1組：全細胞溶解物：野生型M.smegmatis MC2155=1：1混合物；WS2組：全細胞溶解物：野生型M.smegmatis MC2155=9：1混合物。 (8)分別在第7、14、21、28天，各組隨機選擇3只小鼠：眼球取小鼠外周血，分離血清；檢測血清中IFN-γ、IL-6、IL-10、GM-CSF四中細胞因子的水平；取肺部組織，一部分做病理切片觀察病理變化，另一部分用來檢測肺部組織中活菌的數(shù)量。 本實驗的結(jié)論： (1)用氣霧攻擊方式，以5×107CFU/day的濃度構(gòu)建恥垢分枝桿菌C57BL小鼠模型是可行的； (2)高濃度（5×107CFU/day）的恥垢分枝桿菌持續(xù)感染而使小鼠產(chǎn)生肺部病理損傷的原因是Th1/Th2反應(yīng)失衡； (3)恥垢分枝桿菌細胞壁成分LAM能激活Th1反應(yīng)具有免疫調(diào)節(jié)作用； (4) WCL與少量活菌混合后的免疫調(diào)節(jié)作用強于單獨使用LAM，為研發(fā)新的疫苗奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Tuberculosis (Tuberclosis) is a serious respiratory infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis. The consequences are enormous for society. Now 1/3 of the world's population (about 2 billion people) has been infected with Mycobacterium tuberculosis, TB disease accounted for the global 2.5%. although the incidence of tuberculosis than other infectious diseases there is a steady decline rate, but unless there are major research results, sustained high mortality rate of tuberculosis and AIDS will continue until 2020. The merger formed a lethal disease group, each other can accelerate the onset of the process. Such a situation, whether the incidence of tuberculosis and the host immune system there is a very close relationship, therefore, TB has also become.[1,2,3] health problems in the world concern
Mycobacteria include about 100 kinds of bacteria, including Mycobacterium tuberculosis can cause illness, such as Mycobacterium tuberculosis; also includes non pathogenic mycobacteria, such as Mycobacterium smegmatis. Mycobacterium smegmatis is a Mycobacterium tuberculosis and has homology, the rapid growth of a small amount of inoculation of guinea pigs. Rat, [4,5]. mice of Mycobacterium non pathogenic antigen component of the cell wall surface effectively, such as Arabia (LAM), mannose lipid lipoprotein (LP) and whole cell lysate (Whole Cell, Lysate, WCL, [8,9]) is a molecular and host immune system interact with each other, these molecules are safe, immune effective regulator, can effectively promote the Th1 response of the immune system [9].
In the pathogenesis of tuberculosis, experimental study on developing vaccines in animal experiments, [13,17]. method is the most effective and indispensable to the optimum method of constructing Mycobacterium smegmatis mouse model, not only the lowest degree of mice external damage reduction, but also more realistic simulation of human infection with Mycobacterium tuberculosis, in order to to explore the high concentration (5 * 107CFU/day) the feasibility to establish an experimental model of Mycobacterium smegmatis.
The purpose of this experiment is:
(1) in this experiment, we established a mouse model with high concentration (5 x 107CFU/day) of non pathogenic Mycobacterium tuberculosis, and made the pulmonary tuberculosis like lesion in mice lungs by microbiological aerosol attack.
(2) to investigate the causes of pathological damage in the lungs of the non pathogenic Mycobacterium tumefaciens with high concentration (5 * 107CFU/day) in the case of persistent infection.
(3) to explore the stimulation and regulation effect of Arabia mannose (LAM) on the immune system of mice with the surface of Mycobacterium tumefaciens cell wall.
(4) to investigate the effect of WCL on the immune system of mice.
The main methods of this experiment are:
(1) the C57BL mice most sensitive to mycobacteria in inbred animals were selected, and the male mice of the week age were 4-8 weeks old.
(2) the M.Smegmatis mc2155 strain of wild Mycobacterium tumefaciens was cultivated by adding 0.05% Tween80LB liquid medium;
(3) the growth curve of M.Smegmatis mc2155 and OD589 were used to determine the concentration of the bacteria.
(4) extract Arabia mannose (LAM) on the surface of M.Smegmatis mc2155 cell wall of Mycobacterium tumefaciens;
(5) the preparation of M.smegmatis mc2155WCL (Whole Cell Lysate, total cell lysate): the cell and cell lysate were incubated at 37 degrees, 10min, the bacteria solution was ultrasonically broken, power 200W, broken 30s, intermittent 30s, and broken 20-30 cycles.
(6) the experimental animals C57BL mice were randomly divided into 5 groups: blank group, S group, LS group, WS1 group and WS2 group. All animals were divided into cage cage feeding, free diet drinking, feeding conditions kept constant temperature and humidity, and regularly ventilated and sterilized.
(7) mice: the mice were prepared according to the following infection, the use of microbial aerosol aerosol generator preparation of infected matter suspension infected mice in.S group aerosol attack: 5 * 107CFU wild type M.smegmatis MC2155; group LS: 30 g/day LAM pretreatment for two days, third days 5 * 107CFU wild type M.smegmatis MC2155 treatment; group WS1: whole cell lysate of wild-type M.smegmatis MC2155=1:1 mixture; WS2 group: whole cell lysate of wild-type M.smegmatis MC2155=9:1 mixture.
(8) after 7,14,21,28 days, each group randomly selected 3 mice: the eyeball in peripheral blood, separation of serum; the serum IFN- gamma, IL-6, IL-10, GM-CSF four cytokines; take lung tissue, as a part of pathological sections to observe the pathological changes, the other part of the used quantity of live bacteria the detection of lung tissue.
The conclusion of this experiment is:
(1) it is feasible to construct a C57BL mouse model of Mycobacterium foul with the concentration of air mist and the concentration of 5 * 107CFU/day.
(2) the high concentration (5 * 107CFU/day) of Mycobacterium tumefaciens continued to infect, and the cause of lung pathological damage in mice was the imbalance of Th1/Th2 reaction.
(3) the cell wall component LAM of Mycobacterium foul can activate the Th1 reaction with immunomodulatory effect.
(4) the immunomodulatory effect of WCL and a small amount of living bacteria is stronger than the use of LAM alone, which lays the foundation for the development of a new vaccine.

【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R52

【共引文獻】

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本文編號：1533314