本文關(guān)鍵詞： 甲型(H1N1)流感病毒 microRNA 減毒活疫苗 安全性 免疫原性　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的：流行性感冒,簡稱流感,是由流感病毒感染引起的一種急性呼吸道傳染病,嚴(yán)重危害人類健康。全球性的流感大流行危害性尤為嚴(yán)重,甲型流感病毒曾引起了多次大范圍的流行,造成了全球巨大的人力資源和物力資源的損失,極易造成社會動蕩。流感疫苗是防治流感大流行的有效手段。目前常用的流感疫苗主要分為兩類：滅活疫苗與減毒活疫苗。相比之下減毒活疫苗更有優(yōu)勢,①它通過同自然感染相似的鼻腔免疫,同時激發(fā)局部粘膜免疫以及機(jī)體的體液、細(xì)胞免疫反應(yīng),作用時間長。②減毒活疫苗可以通過滴鼻途徑給藥,避免了注射途徑帶來的問題。③可提供有效的交叉免疫保護(hù)。傳統(tǒng)的冷適應(yīng)流感減毒活疫苗制備過程復(fù)雜,耗時長,難以滿足流感大流行時疫苗的需求。研發(fā)安全、高效、易于生產(chǎn)的減毒活疫苗是新型流感疫苗的發(fā)展方向。microRNA (miRNA)介導(dǎo)的流感弱毒株快速構(gòu)建方法具有良好的前景。本課題利用microRNA介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制設(shè)計(jì)一種全新的病毒減毒策略。microRNA (miRNA)是一類進(jìn)化上保守的非編碼小分子RNA,與其靶序列的結(jié)合,可抑制其翻譯。并且miRNA的分布具有組織特異性。根據(jù)上述兩個特點(diǎn),將miRNA的結(jié)合靶位裝載進(jìn)病毒基因組,在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中,內(nèi)源性miRNA與其靶序列結(jié)合,抑制病毒RNA在特定組織的翻譯及病毒的增殖,從而導(dǎo)致減毒。本課題組前期選擇肺組織內(nèi)源性高表達(dá)的let-7b作為靶向miRNA,將其結(jié)合靶位裝入南京2009甲型H1N1流感病毒株(A/Nanjing/108/2009 H1N1)的RNA聚合酶復(fù)合物中的PB1片段編碼區(qū),并采用反向遺傳學(xué)方法拯救出重組流感病毒miRT-H1N1。在體外實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)miRT-H1N1在miR-let-7b高表達(dá)的人支氣管上皮細(xì)胞中(human bronchial epithelial cell line HBE)復(fù)制受限,毒力下降。miR-let-7b通過與其靶序列的結(jié)合,抑制miRT-H1N1的PB1合成從而抑制miRT-H1N1的復(fù)制。本課題組前期研究在細(xì)胞水平上證實(shí)了miRT-H1N1的減毒作用,但miRT-H1N1是否可成為有效的流感病毒減毒株,還需要通過動物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。我們選用Balb/c小鼠進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。其優(yōu)點(diǎn)在于：小鼠的生理生化和發(fā)育與人類相似；遺傳背景均一,試驗(yàn)結(jié)果精確可靠；與鼠相關(guān)的細(xì)胞因子等試劑已商品化；有研究證明Balb/c小鼠對高致病性的流感病毒易感性高,2009新型H1N1病毒可在Balb/c小鼠內(nèi)復(fù)制,不需要培養(yǎng)預(yù)適應(yīng)株,可作為流感候選疫苗評價的動物模型。本研究的目的就是通過鼻腔免疫BALB/c小鼠的方法驗(yàn)證miRT-H1N1是否在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)減毒,初步評估其安全性。然后從體液免疫、細(xì)胞免疫、粘膜免疫三個方面研究miRT-H1N1的免疫原性,并評價miRT-H1N1對小鼠的免疫保護(hù)性。為microRNA介導(dǎo)的流感病毒減毒活疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。方法：1.miRT-H1N1的致病力研究應(yīng)用血凝試驗(yàn)測定三種病毒miRT-H1N1、scbl-H1N1和wt-H1N1的血凝素(HA)效價,并用組織細(xì)胞培養(yǎng)法檢測這三種病毒在雞胚中的半數(shù)組織細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)。選用6周齡BALB/c雌性小鼠為動物模型,按病毒種類(miRT-H1N1、 scbl-H1N1和wt-H1N1)及不同梯度劑量分組,每組10只,PBS對照組每組5只。將各個稀釋度(107TCID50～103TCID50)病毒液滴鼻感染小鼠,連續(xù)觀察14天,記錄體重變化和死亡情況,Reed-Muench法計(jì)算小鼠MLD50。將12只6周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為3組(miRT-H1N1組、scbl-H1N1、wt-H1N1),每組4只,經(jīng)鼻滴入105TCID50病毒液,分別于感染后第3、5天取肺組織,檢測病毒載量。感染第3天,取小鼠肺組織,抽提其病毒RNA,用RT-PCR法擴(kuò)增miRT-H1N1和WT-H1N1的PB1基因片段,送檢測序。2. miRT-H1N1的免疫原性研究將6周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為miRT-H1N1組和PBS對照組,每組6只,第1次免疫后28天加強(qiáng)免疫1次。采集第一次免疫后28天,第二次免疫后14天小鼠血清,應(yīng)用血凝抑制試驗(yàn)(HI)、病毒中和試驗(yàn)(MN)和免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(ELISA),分別測定血凝抑制抗體、血清病毒中和抗體和血清抗體IgG。采集第2次免疫后14天鼻腔、肺臟沖洗液,經(jīng)ELISA測定分泌性抗體(sIgA)。采集第2次免疫后14天小鼠脾細(xì)胞懸液,經(jīng)ELISA測定IFN-y和IL-4水平。3. miRT-H1N1的免疫保護(hù)性研究將6周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為miRT-H1N1組和PBS對照組,每組12只,免疫方法同前。在第二次免疫后14天通過滴鼻方式給予100LD50的H1N1流感病毒進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。其中6只觀察小鼠14天內(nèi)體重變化及存活率,另外6只小鼠于攻毒第3,5天處死,采集小鼠肺組織病理切片HE染色觀察病理變化,參照Cimolai等的病理評分系統(tǒng)行肺組織病理評分IPS (Histopathologic Score)。并用組織細(xì)胞培養(yǎng)法檢測肺組織病毒載量。RT-PCR法檢測攻毒第3、5天小鼠肺組織炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。結(jié)果：1.miRT-H1N1的致病力研究(1)體外實(shí)驗(yàn)中,三種病毒miRT-H1N1、scbl-H1N1及WT-H1N1的血凝素(HA)效價分別為1：29、1：28、1：28。雞胚中培養(yǎng)的miRT-H1N1病毒滴度與WT-H1N1, scbl-H1N1的相似,三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)小鼠體重變化及半數(shù)致死量：成功構(gòu)建了2009甲型H1N1流感病毒株(A/Nanjing/108/2009 H1N1)感染BALB/c小鼠模型。實(shí)驗(yàn)觀察到WT-H1N1組小鼠自感染病毒第3天開始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍,食欲減退,體重下降等癥狀,第5至8天小鼠體重陸續(xù)下降超過原始體重的25%,實(shí)施安樂死,其中107TCID50劑量組全部死亡。與之相反,感染miRT-H1N1的小鼠活動基本正常,即使感染最高劑量(107TCID50)的miRT-H1N1,小鼠體重下降也不明顯(10%),沒有出現(xiàn)死亡,即LD50107TCID50。 WT-H1N1與scbl-H1N1組的半數(shù)致死量相似,分別為105.3TCID50,105.38 TCID50。(3)小鼠肺組織病毒載量：在感染第3、5天小鼠的肺組織內(nèi)均可分離出病毒,感染第3天wt-H1N1組的病毒滴度與scb1-H1N1組相似,分別為10537TCID50/g,105.49 TCID50/g,而miRT-HlN1組的病毒滴度為103.50 TCID50/g,明顯低于野毒株(P0.05)。感染第5天,三組病毒滴度有所下降,分別為103.71、103.49、101.5 TCID50/g,與wt-H1N1組、scbl-H1N1組相比,miRT-H1N1組的病毒滴度明顯降低,下降超過100倍(P0.05)。用RT-PCR法擴(kuò)增小鼠肺組織中miRT-H1N1和WT-H1N1的PB1基因片段,電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增到了特異性的目的條帶,測序確認(rèn)重組突變病毒miRT-H1N1包含突變目標(biāo)序列,未發(fā)現(xiàn)有病毒逃逸突變體。2. miRT-H1N1的免疫原性研究(1) miRT-H1N1免疫后小鼠體液免疫應(yīng)答效果：miRT-H1N1滴鼻免疫BALB/c小鼠28天后即可刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生較高水平的血1gG、HI和病毒中和抗體,抗體幾何平均滴度分別為905、403、227,二免14天小鼠體內(nèi)血清抗體滴度達(dá)到最高,分別為2873、2032、313,與PBS對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第2次免疫后小鼠血清1gG、HI水平較第1次免疫后明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2) miRT-H1N1免疫后小鼠粘膜免疫應(yīng)答效果：1niRT-H1N1免疫的小鼠鼻沖洗液和肺沖洗液均可檢測到sIgA,抗體幾何平均滴度分別為16、64,而PBS對照組的sIgA10,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3) miRT-H1N1免疫后小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答效果：予以miRT-H1N1 2次免疫小鼠后,特異性HA抗原與免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清測定IFN-γ、IL-4結(jié)果顯示,PBS對照組小鼠IFN-γ、IL-4兩種細(xì)胞因子的濃度很低,分別為17.4pg/ml、24.1pg/ml,而miRT-H1N1組用HA刺激后,IFN-γ、IL-4分別達(dá)到了54.5pg/ml、70.9pg/ml,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示miRT-H1N1在小鼠體內(nèi)能夠同時誘導(dǎo)Thl和Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答。3. miRT-H1N1的攻毒保護(hù)性研究(1)攻毒實(shí)驗(yàn)中小鼠體重變化及生存率：同源流感病毒wt-H1N1攻毒后第2天開始,用PBS免疫的小鼠即開始出現(xiàn)食欲減退,活動減少等癥狀,體重下降明顯,最低下降到原體重的72.5%,下降程度超過原始體重的25%,對小鼠實(shí)施安樂死,至攻毒第8天,小鼠全部死亡,存活率為0。與之相反,用miRT-H1N1免疫的小鼠活動基本正常,體重輕度下降,攻毒第8天后體重恢復(fù)至初始體重,存活率達(dá)到了100%。(2)攻毒后小鼠肺組織病毒載量、病理及炎癥因子變化：攻毒第3天,miRT-H1N1組小鼠肺組織病毒滴度為101.53 TCID50/g,明顯低于PBS對照組的105.13 TCID50/g (P0.05)。攻毒第5天,PBS對照組小鼠肺組織病毒滴度下降至103.8TCID50/g,而miRT-H1N1組小鼠肺組織中未分離出病毒。攻毒第5天,PBS組小鼠肺組織出現(xiàn)了嚴(yán)重的病理改變,包括肺泡結(jié)構(gòu)塌陷,壞死性支氣管炎,組織廣泛出血等,相比之下,miRT-H1N1組小鼠肺組織只有輕微的組織病理變化。與之一致的是PBS對照組小鼠肺組織病理學(xué)評分高達(dá)20.3,而miRT-H1N1組小鼠肺組織病理學(xué)評分僅為7.3,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。攻毒第3天miRT-H1N1組小鼠肺組織炎癥因子IL-6, TNF-α, IFN-β的mRNA相對表達(dá)量分別為(2.6±0.8,2.4±0.4,10.6±4.7),低于PBS對照組(10.7±1.6,4.4±1.1,39.7±15.5)(P0.05)。攻毒第5天小鼠體內(nèi)相關(guān)炎癥反應(yīng)有所減弱,miRT-H1N1組小鼠肺組織IL-6, TNF-α, IFN-β的mRNA相對表達(dá)量分別為(1.5±0.3,1.3±0.1,2.3±0.6),低于PBS對照組(4.0±1.2,3.0±0.9,2.3±0.6)(P0.05)。結(jié)論：1.miRT-H1N1在BALB/c小鼠肺組織中的毒性較WT-H1N1、scb1-H1N1顯著減弱,其致病力較野毒株明顯降低。表明了microRNA介導(dǎo)甲型H1N1流感減毒株在小鼠體內(nèi)的安全性。但是miRT-H1N1在雞胚中的生長特性卻與野毒株相同,表明miRT-H1N1可以在體外采用雞胚培養(yǎng)的方式大量制備。2. miRT-H1N1具有良好的免疫原性,可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫、粘膜免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng),從而產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)效果,完全保護(hù)小鼠抵抗流感病毒的攻擊。本研究為microRNA介導(dǎo)流感減毒疫苗的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R511.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;什么方式可以殺滅甲型H1N1流感病毒?[J];中華疾病控制雜志;2009年03期

2 ;為什么“豬流感病毒”改稱甲型H1N1流感病毒?[J];中華疾病控制雜志;2009年03期

3 高峰;;甲型H1N1流感病毒大流行的預(yù)防應(yīng)重視兒童及中青年患者[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策論壇版);2009年07期

4 李皓;;流感病毒與防控措施[J];科技潮;2009年12期

5 魏成軍;江新泉;高佩安;;甲型H1N1流感病毒特征及快速檢驗(yàn)方法[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2011年04期

6 陳慧英;;流感病毒將可“定位追蹤”[J];瀘州科技;2013年03期

7 苗鳳源;;經(jīng)鼻接種A型流感病毒對鼷鼠嗅粘膜的影響[J];國外醫(yī)學(xué).耳鼻咽喉科學(xué)分冊;1987年02期

8 劉美琴,白小平,樊陜生,肖和宇;B型流感病毒流感22例報告(摘要)[J];臨床兒科雜志;1988年06期

9 郝莉萍;于樹芬;俞秀廉;齊云華;;荊、防、柴、菊抑制流感病毒的實(shí)驗(yàn)研究[J];人民軍醫(yī);1992年11期

10 鄭賓;鐘江;;禽流感蔓延給人類敲響警鐘[J];科學(xué)生活;2005年11期

相關(guān)會議論文 前10條

1 伍銳;段正贏;劉澤文;楊克禮;梁望旺;鄧均華;周丹娜;田永祥;;A型流感病毒為載體的開發(fā)及其應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第八次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

2 杜雄偉;李葉;楊卓;;A型流感病毒對小鼠致病機(jī)制的研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2009年

3 曲敬來;;流感病毒A上呼吸道感染快速診治的研究[A];中醫(yī)藥防治感染病之研究（九）——第九次全國中醫(yī)藥防治感染病學(xué)術(shù)交流大會論文集[C];2009年

4 高福;;流感病毒侵入與多肽抑制藥物[A];第二屆傳染病診治高峰論壇暨2009年浙江省感染病、肝病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

5 楊琴;張興曉;楊靈芝;郭慶棟;;流感病毒在三種細(xì)胞中的生長對比[A];山東畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)專業(yè)委員會第一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

6 袁達(dá)康;黃勇;楊華可;黎景全;李艷芬;;東莞市2004-2008年流感病毒監(jiān)測結(jié)果及分析[A];新發(fā)傳染病防治學(xué)習(xí)研討會論文集[C];2008年

7 高玉偉;夏咸柱;扈榮良;王立剛;劉丹;鄒嘯環(huán);黃耕;賀文琦;;虎流感病毒的分離、鑒定、基因分析與抗體調(diào)查(摘要)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會成立20周年慶典暨第十次學(xué)術(shù)研討會論文集（下）[C];2003年

8 李葉;廖明;辛朝安;;A型流感病毒對小鼠致病機(jī)制的研究進(jìn)展[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

9 曲敬來;常曉;;流感病毒A上呼吸道感染快速診治的研究[A];2005年全國危重病急救醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議學(xué)術(shù)論文集[C];2005年

10 祝艷華;王雯慧;陳懷濤;;中藥抗流感病毒作用的研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)病理學(xué)分會第十五次、中國病理生理學(xué)會動物病生專業(yè)委員會第十四次學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 江卉邋通訊員 胡運(yùn)海 實(shí)習(xí)生 汪紅燕;今冬江城流感病毒有加劇趨勢[N];湖北日報;2008年

2 ;新流感病毒可能已在豬身上悄悄傳播多年[N];新華每日電訊;2009年

3 記者 葛進(jìn)　陳超;日拍到新型流感病毒真實(shí)形態(tài)[N];科技日報;2009年

4 特約記者 吳志軍　記者 蔡鵬程;研制成功迅速殺滅流感病毒新產(chǎn)品[N];解放軍報;2009年

5 河北省邢臺市第一醫(yī)院副主任醫(yī)師 黃根柱;流感病毒有四怕[N];健康報;2009年

6 本報記者 馬佳;陳繼明：為流感病毒繪制族譜[N];北京科技報;2009年

7 江南雪舞;禽流感病毒與流感病毒有何關(guān)系？[N];大眾衛(wèi)生報;2005年

8 主任醫(yī)師 冀衡;流感病毒[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2003年

9 楊孝文　編譯;揭開20世紀(jì)初西班牙大流感致命秘密[N];北京科技報;2007年

10 本報駐美國記者 毛黎;“狼”依然在家門口徘徊[N];科技日報;2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張文婧;抗A型流感病毒和腸道病毒71型天然化合物的篩選及其抗病毒分子機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2012年

2 吳玲;A型流感病毒四種亞型同步檢測分型方法建立及兩株H5N1亞型禽流感病毒地方株的特性研究[D];武漢大學(xué);2013年

3 范文輝;犬Ⅲ型干擾素的功能特點(diǎn)及B型流感病毒NEP蛋白出核功能研究[D];廣西大學(xué);2015年

4 申新田;寡聚噻吩及皂苷類衍生物抑制流感病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的作用及機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

5 趙化陽;小鼠動物模型在哮喘氣道高反應(yīng)治療和抗流感藥物篩選中的應(yīng)用研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 萬志敏;抗體壓下H9N2流感病毒囊膜糖蛋白關(guān)鍵抗原表位氨基酸的變異分析[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

7 林焱;H3N2亞型犬流感病毒江蘇分離株基因組特征與致病特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

8 高偉;新型甲型H1N1流感病毒致ALI發(fā)病機(jī)制研究—炎癥、細(xì)胞凋亡以及免疫調(diào)控[D];南京大學(xué);2012年

9 陽元娥;抗甲型流感病毒卵黃抗體的制備、活性評價及其應(yīng)用研究[D];廣東工業(yè)大學(xué);2016年

10 江靜雯;B型流感病毒誘發(fā)天然免疫應(yīng)答及M1核質(zhì)穿梭對于病毒復(fù)制的調(diào)控研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 胡云光;人季節(jié)性流感病毒H3N2小鼠適應(yīng)株的建立及分子機(jī)制的初步探究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

2 劉兵;SPF雞與BALB/c小鼠體內(nèi)流感病毒唾液酸受體組織分布的差異性分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

3 劉曉艷;復(fù)方龍芩草微乳液抗H1N1流感病毒的作用、物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

4 李巍巍;粗粒度下流感病毒基因網(wǎng)絡(luò)信息的建模與應(yīng)用[D];江南大學(xué);2016年

5 趙苗苗;廣東省H3N2亞型犬流感血清流行病學(xué)調(diào)查和病毒的分離、鑒定及遺傳進(jìn)化分析[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 資海榮;江蘇省2010-2014年流感監(jiān)測及甲型H1N1分子流行病學(xué)研究[D];東南大學(xué);2015年

7 孟麗君;宿主蛋白CDC25B調(diào)控A型流感病毒復(fù)制以及流感病毒NA蛋白ELISA方法建立的研究[D];安徽大學(xué);2016年

8 姜穎越;重組hIFITM3腺病毒的構(gòu)建及抗流感病毒作用研究[D];延邊大學(xué);2016年

9 金夢哲;全球背景下人源甲型流感病毒傳播行為分析[D];石家莊鐵道大學(xué);2016年

10 王艷翠;CXCL4在小鼠呼吸道感染甲型流感病毒H1N1中的生物學(xué)作用及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

，

本文編號：1513242