缺血性腦卒中在中醫(yī)稱“中風”｡中醫(yī)學認為中醫(yī)證型具有分子遺傳基礎(chǔ),既往研究表明,基因的差異表達及基因序列的多態(tài)性決定了個體的差異,在臨床則表現(xiàn)為不同的證候群｡螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域擴散激酶(conserved helix-loop-helixubiquitous kinase,CHUK)基因編碼的蛋白質(zhì)是核因子NF-kappa-B復(fù)合物的抑制劑,可影響NF-kappa-B通路的活性,有研究表明NF-kappa-B通路參與腦卒中的病理過程[3],因此,CHUK基因可能參與腦卒中的病理過程｡本研究旨在分析CHUK基因在不同中風患者與對照組中的表達差異,并探討CHUK基因多態(tài)性位點(rs3808916､rs2230804､rs3808917)與中風證型及炎性反應(yīng)的關(guān)聯(lián)性｡

一､資料

1.資料來源

病例需同時符合西醫(yī)診斷標準和中醫(yī)診斷標準｡病例組來自于2009年7月至2014年6月在廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)腦病科住院的缺血性中風患者｡對照組來自同期的廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院體檢中心參加健康體檢的正常人以及骨科等患非神經(jīng)系統(tǒng)疾病且病情較輕微的住院患者｡

2.診斷標準
西醫(yī)診斷標準:參照1995年全國第四屆腦血管病學術(shù)會議修訂的《各類腦血管病診斷要點》缺血性腦卒中診斷,均經(jīng)頭顱CT和/或MRI確診,每個病例均經(jīng)過至少2名主治以上職稱的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師診斷一致｡
中醫(yī)診斷標準及證候辨證分型標準:依據(jù)1996年國家中醫(yī)藥管理局全國腦病急癥科研協(xié)作組制訂的《中風病診斷療效評定標準(試行)》｡每例缺血性中風患者均經(jīng)2名經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)的主治以上職稱的中醫(yī)醫(yī)師進行中醫(yī)證候分型,若2名中醫(yī)醫(yī)師辨證結(jié)果不一致,則提交由3名副高以上職稱的中醫(yī)醫(yī)師組成的專家小組討論后確定中醫(yī)證候類型｡
本研究選擇風痰瘀阻證､氣虛血瘀證這兩個臨床上常見的中風證型進行研究,風痰瘀阻證診斷標準為:半身不遂,口舌歪斜,言語蹇澀或不語,感覺減退或消失,頭暈?zāi)垦?痰多而黏,舌質(zhì)暗淡,舌苔薄白或白膩,脈弦滑｡氣虛血瘀證診斷標準為:半身不遂,口舌歪斜,言語蹇澀或不語,感覺減退或消失,面色胱白,氣短乏力,自汗出,舌質(zhì)暗淡,舌苔白膩或有齒痕,脈沉細｡

3.排除標準
病例組排除腫瘤､腦外傷､腦血管畸形以及心臟源性栓塞等其他原因引起的缺血性中風;合并自身免疫性疾病等嚴重系統(tǒng)性疾病者;嚴重心､肝､腎功能障礙｡對照組排除合并自身免疫性疾病等嚴重系統(tǒng)性疾病者;存在嚴重心､肝､腎功能障礙者;體檢前2周有感染､發(fā)熱等炎性疾病者｡

4.研究對象
共納入缺血性中風595例,包括:風痰瘀阻證311例,平均年齡(64.46±10.90)歲;氣虛血瘀證284例,平均年齡(66.99±10.45)歲｡納入對照605例,平均年齡(65.56±12.45)歲｡風痰瘀阻證患者與對照組在性別､年齡上的差異均無統(tǒng)計學意義,氣虛血瘀證與對照組在性別､年齡上的差異亦無統(tǒng)計學意義｡所有對象均自我報告為廣西漢族人,相互之間無親緣關(guān)系,且均知情同意｡


二､方法

1.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)
抽取研究對象外周靜脈血2mL,置于枸櫞酸抗凝管內(nèi),于采血后6h內(nèi)分離血清及血細胞(3 000r/min,離心10min),血清放置于-80℃冰箱保存以備用于炎性細胞因子血清水平測定｡采用Trizol法(美國Invitrogen公司提供)提取外周血單核細胞中總RNA,使用PrimeScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄｡
本研究以GAPDH為管家基因,管家基因上游引物序列5’-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3’下游引物序列5’-GTT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3’;CHUK基因為目的基因,上游引物序列為5’-TGC CTT GGC CAT TTA AGCACT A-3’下游引物序列5’-GGG ACA GTG AAC AAG TGACAA CTC-3’｡
管家基因GAPDH和目的基因CHUK引物設(shè)計由Primer Premier5軟件設(shè)計并由上海生工生物工程股份有限公司合成｡采用SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(大連TAKARA公司提供)和BIO-RAD伯樂CFX96儀器按照實驗步驟實行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定CHUK基因mRNA表達水平｡
RT-PCR反應(yīng)體系(總體系為20.0μL)構(gòu)建如下:SYPR PremixEx Taq:10.0μL;上游引物:0.4μL;下游引物:0.4μL;cDNA模板:2μL;ddH 2 O:7.2μL｡PCR反應(yīng)條件如下:95℃30s;95℃5s;60℃30min,40循環(huán)｡GAPDH和CHUK在健康對照和缺血性腦卒中的表達水平是通過2-detadetaCT計算,共完成36例缺血性中風風痰瘀阻證､37例氣虛血瘀證､85例對照的外周血CHUK基因mRNA表達水平測定及數(shù)據(jù)分析｡

2.基因分型檢測
采集研究對象外周靜脈血2mL,置于EDTA管內(nèi),混勻,4℃保存,于7d內(nèi)完成DNA提取｡采用北京天根科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒[TIANampBlood DNA Kit(離心柱形)],嚴格按照產(chǎn)品說明書操作步驟進行血液基因組DNA的提取,并分裝為3管,放置于-80℃保存?zhèn)溆?#65377;采用北京博淼生物公司的Sequenom MassARRAY iPLEX實驗平臺進行基因分型｡

3.炎性細胞因子血清水平測定
炎性細胞細胞因子測定的血清樣本與RT-PCR的樣本來自于同一研究對象｡運用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)技術(shù)檢測5個炎性細胞因子(IL-1b,IL-6,IL-8,IL-12,TNF-α)的血清含量,采用Raybiotech公司QAH-TH17-1試劑盒進行同步檢測｡共完成42例氣虛血瘀證､100例對照的炎性細胞因子表達水平測定及數(shù)據(jù)分析｡

4.統(tǒng)計學方法

采用PLINK軟件進行基因型與表型的遺傳關(guān)聯(lián)分析｡采用擬和優(yōu)度卡方檢驗進行HWE平衡分析｡以比值比(OR)及其95%可信區(qū)間表示相對危險度｡采用linearregression分析各位點多態(tài)性與數(shù)量性狀的關(guān)聯(lián)｡運用QAH-TH17-1的數(shù)據(jù)分析軟件來進行細胞因子數(shù)據(jù)分析｡其它數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包:計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗,計量資料的兩組間比較采用獨立樣本t檢驗(正態(tài)分布)或者秩和檢驗(非正態(tài)分布)｡所有統(tǒng)計學檢驗均為雙側(cè)檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義｡

三､結(jié)果

1.CHUK基因表達水平測定
中風風痰瘀阻證患者的CHUK基因表達水平顯著高于對照組(P<0.01),氣虛血瘀證患者的CHUK基因表達水平也顯著高于對照組(P<0.01),差異具有統(tǒng)計學意義｡

2.CHUK基因多態(tài)性位點的Hardy-Weinberg Equilibrium(HWE)分析以及基因型分布比較
擬和優(yōu)度卡方檢驗結(jié)果顯示,CHUK基因的3位點在風痰瘀阻證(rs3808916:T/T 7例､T/C 90例､C/C 214例;rs2230804:G/G 62例､G/A 166例､A/A 83例;rs3808917:A/A 30例､A/C 135例､C/C 146例)和氣虛血瘀證(rs3808916:T/T 6例､T/C 79例､C/C 199例;rs2230804:G/G58例､G/A 141例､A/A 85例;rs3808917:A/A 25例､A/C 132例､C/C 127例)患者中,基因型分布均符合HWE平衡定律(均為P>0.050)｡

3.CHUK基因多態(tài)性與缺血性中風不同證型易感性的關(guān)聯(lián)分析
CHUK基因的3個SNPs(rs3808916,rs2230804,rs3808917)多態(tài)性與缺血性中風風痰瘀阻證的易感性均無統(tǒng)計學關(guān)聯(lián),而且,這3個SNPs與氣虛血瘀證易感性的關(guān)聯(lián)也無統(tǒng)計學意義｡

4.CHUK基因多態(tài)性與缺血性中風不同證型患者炎性細胞因子血清水平的關(guān)聯(lián)分析
氣虛血瘀證:rs2230804位點AA基因型攜帶者的IL-8､TNF-α血清含量均顯著低于GG+GA基因型攜帶者(P<0.05,P<0.01),見圖2､圖3｡rs3808917位點AA基因型攜帶者的TNF-α血清含量顯著低于CC+CA基因型攜帶者,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖4｡但在風痰瘀阻證中,3個位點不同基因型攜帶者之間的與所有測定的炎性細胞因子水平均無統(tǒng)計學差異｡

5.缺血性中風氣虛血瘀證患者與對照組的炎性細胞因子血清水平的比較

氣虛血瘀證患者IL-8和TNF-α血清含量顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)｡

四､討論

缺血性中風屬中醫(yī)學“中風”范疇,其主要病機為本虛標實,即以氣虛､陰虛為本,風､火､痰､瘀為標｡中醫(yī)醫(yī)家認為中風病因為大率多痰,在左屬死血瘀,在右屬痰有熱,并氣虛｡或因虛生風化痰,因虛致瘀,最后致痰瘀阻絡(luò),發(fā)為中風,因此,痰濁瘀血阻絡(luò)被認為是中風發(fā)生的最直接的病機｡有學者指出痰濁瘀血與動脈粥樣硬化有關(guān),而炎性反應(yīng)是腦動脈粥樣硬化的主要致病因素｡中醫(yī)學“風痰瘀阻證”與“氣虛血瘀證”與現(xiàn)代醫(yī)學中的炎性反應(yīng)存在相關(guān)的生物學基礎(chǔ)｡
CHUK基因編碼核因子NF-kappa-B復(fù)合物的一種抑制劑,其編碼的蛋白可使NF-kappa-B信號通路上的節(jié)點磷酸化,從而激活核錄因子NF-kappa-B,最終促進成套促炎基因的表達,進而促進了動脈粥樣硬化形成｡
本研究發(fā)現(xiàn)CHUK基因在中風風痰瘀阻證､氣虛血瘀證及對照組中均有表達,且在兩個證型中的表達量較對照組均顯著升高,表明CHUK基因mRNA可能參與了中風風痰瘀阻證､氣虛血瘀證的發(fā)生機制｡與本研究結(jié)果相似的是,既往研究也發(fā)現(xiàn)了一些與中醫(yī)證型發(fā)生發(fā)展相關(guān)的差異表達基因｡張家仕報道冠心病痰濁證､氣虛血瘀證患者的MiRNA-499基因表達水平均顯著高于對照,表明MiRNA-499基因mRNA影響冠心病中醫(yī)證型的發(fā)生發(fā)展｡陸瑞敏等發(fā)現(xiàn),糖尿病動脈粥樣硬化氣虛血瘀證患者的單核細胞COX-2 mRNA表達水平較健康對照組顯著偏高,說明COX-2基因mRNA影響糖尿病動脈粥樣硬化患者氣虛血瘀證的發(fā)生｡上述研究表明,易感基因mRNA表達水平影響中醫(yī)證型的發(fā)生,提示中醫(yī)辨證分型具有分子生物學基礎(chǔ)｡
我們進一步探索CHUK基因遺傳多態(tài)性對于中風證型發(fā)生風險及炎性反應(yīng)的影響｡我們的研究未觀察到CHUK基因多態(tài)性(rs3808916,rs2230804,rs3808917)與中風風痰瘀阻證､氣虛血瘀證發(fā)生風險顯著關(guān)聯(lián)｡但是,本研究發(fā)現(xiàn),rs2230804多態(tài)性影響氣虛血瘀證患者的IL-8､TNF-α血清含量,而rs3808917亦影響氣虛血瘀證患者的TNF-α血清表達水平,表明CHUK基因多態(tài)性可能參與中風氣虛血瘀證的炎性反應(yīng)過程｡Parreira J等發(fā)現(xiàn)在中風患者TNF-β基因rs909253TNFB2等位基因攜帶者血清中TNF-α水平較其他基因型攜帶者顯著升高;Ayhan等在支氣管擴張的研究中也發(fā)現(xiàn)IL-8基因的-251A/T基因型攜帶者血清中IL-8水平較其他基因型攜帶者顯著升高｡這些研究提示基因多態(tài)性可能影響細胞因子水平｡
另外,在炎性細胞因子與中醫(yī)證型的研究中,王永炎院士提出“毒損腦絡(luò)”概念,其中“毒”包含有“痰”“瘀”,這概念對應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學“炎性反應(yīng)”,即痰､瘀積聚致病與中風血栓形成后炎性因子表達致神經(jīng)損傷相一致｡
本研究觀察到IL-8和TNF-α在氣虛血瘀證患者的血清含量顯著高于對照組,與本結(jié)果一致的是尚麗霞等發(fā)現(xiàn)

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本文編號：882136