本文關(guān)鍵詞：皮蠅素轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及其抑制皮膚移植排斥的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：器官移植作為治療終末期器官衰竭患者的一種較有效的方法,在臨床上得到了越來越廣泛的應(yīng)用,這也使人類器官供體相對缺乏的狀況越來嚴(yán)重,激起人們對異種移植的強(qiáng)烈興趣。然而,異種移植后將出現(xiàn)比同種異體移植更復(fù)雜的排斥反應(yīng)。如何解決是保證異種器官移植成功關(guān)鍵因素。移植器官“寄生蟲化”,及移植器官表達(dá)寄生蟲某些分泌蛋白,使移植物能模擬寄生蟲產(chǎn)生“免疫逃避”,從而長時間在受體內(nèi)成活,這一策略為解決異種器官移植排斥反應(yīng)提供了新思路。皮蠅素是一種可降解補(bǔ)體的絲氨酸蛋白酶,它們在寄生蟲和宿主相互關(guān)系之間起著重要作用。幫助寄生蟲應(yīng)對宿主組織的侵襲,幫助逃避宿主的免疫系統(tǒng)。本研究通過轉(zhuǎn)基因動物方式,使移植器官分泌皮蠅素A、C蛋白酶,建立移植器官“寄生蟲化”動物模型,應(yīng)用此模型進(jìn)一步研究皮蠅素與補(bǔ)體系統(tǒng)作用機(jī)制。移植器官分泌皮蠅素抑制受體補(bǔ)體激活,調(diào)節(jié)各種異種移植排斥反應(yīng),延長移植物存活時間,為解決異種器官移植排斥反應(yīng)提供新途徑。1.皮蠅素分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建分泌型真核表達(dá)載體pEF1-CD-HA-AcGFP和pEF1-CD-HC-AcGFP,該載體以EF1為啟動子,牛皮蠅一期幼蟲RT-PCR擴(kuò)增出HA、HC基因cDNA為目的基因,序列上游融合IgK-chain secretion signal信號肽序列。將融合基因序列插入PEFla-IRES-AcGFP多克隆位點,應(yīng)用核酸內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切,構(gòu)建pEFl-CD-HA-AcGFP和pEF1-CD-HC-AcGFP重組分泌型真核表達(dá)載體。將構(gòu)建好的質(zhì)粒測序,正向反向測序結(jié)果與預(yù)期符合,用于下一步體外轉(zhuǎn)染實驗和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灐?.皮蠅素A抗體的制備及鑒定皮蠅素A(Hypodermin A HA)具有很好的免疫原性,以其作為免疫抗原,可以使被免疫的動物產(chǎn)生對牛皮蠅幼蟲的感染具有保護(hù)性的抗體。利用生物信息學(xué)對HA的抗原性及其親水性進(jìn)行分析,提示該氨基酸具有較好的抗原性。并發(fā)現(xiàn)抗原表位主要分布在氨基酸的C端101-116,161-173,37-50的三個區(qū)域。通過RP-HPLC方法測定人工合成的多肽發(fā)現(xiàn)其純度達(dá)到91.2%,并通過質(zhì)譜鑒定分子量與預(yù)計的分子量吻合為28 kD。然后與KLH連接,免疫新西蘭大白兔,得到了HA的多肽抗體。采用ELISA和western blotting方法驗證了抗體的特異性。ELISA結(jié)果顯示制備的HA多肽抗體特異性識別多肽,且滴度較高。并同時從牛皮蠅一期幼蟲中提取蛋白,對制備抗體、陰性血清和陽性血清進(jìn)行western blotting檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備抗體和陽性血清分別在28KD處有目的條帶,而陰性血清沒有目的條帶。制備得到的HA多克隆抗體。為進(jìn)一步研究HA的分子功能,提供了有用的工具。3.皮蠅素轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染實驗pEF1--CD-HA-AcGFP和pEF1--CD-HC-AcGFP體外轉(zhuǎn)染及抗補(bǔ)體損傷研究,應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞,RT-PCR與western blot檢測HA、HC是否成功表達(dá)；并用G418篩選得到了HA和HC的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。免疫共沉淀實驗檢測HA與C3是否相互作用。HA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞分別與10%、40%的豚鼠血清37℃孵育100 min,western blot與ELISA方法結(jié)果顯示,占比為10%的豚鼠血清與HA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞孵育后,HA組較陰性對照達(dá)到了極顯著水平。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)HA與C3相互作用。通過EMSA實驗發(fā)現(xiàn),HA通過主鏈底物結(jié)合位點(S225,T226,G227)與C3相互作用。同樣將HC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞分別與10%、30%、50%的豚鼠血清37℃孵育100 min,western blot與ELISA方法結(jié)果顯示,占比為10%及30%的豚鼠血清組中,HC組較陰性對照達(dá)到了顯著水平。EMSA實驗發(fā)現(xiàn),HC通過結(jié)合位點(S229,G230,A231)與C3相互作用。4.皮蠅素轉(zhuǎn)基因模型鼠的制備顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠,Apal I, StuI內(nèi)切酶雙酶切pEF1-CD-HA-AcGFP, pEF1--CD-HC-AcGFP,回收序列為基因構(gòu)件,顯微注射入FVB小鼠和C57BL/6J小鼠受精卵雄性原核內(nèi),移植至假孕母鼠輸卵管,小鼠出生后剪尾提DNA,分別設(shè)計引物PCR檢測目的基因HA、HC。結(jié)果顯示,HA獲得4只陽性首建鼠,HC獲得9只首建鼠,陽性鼠分別與正常FVB小鼠和C57BL/6J小鼠雜交擴(kuò)群。5.模型鼠器官異種移植、抑制移植排斥反應(yīng)研究皮膚通常是高度敏感的,皮膚移植通常被認(rèn)為是會引起非常強(qiáng)的排斥反應(yīng),本研究中,將HA轉(zhuǎn)基因小鼠來進(jìn)行小鼠皮膚移植實驗,來研究HA的免疫抑制作用及對補(bǔ)體成分的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HA轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚移植存活的時間與對照組相比明顯延長,表明在體內(nèi)HA也具有較好的免疫抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)HA通過裂解補(bǔ)體C3,延長補(bǔ)體活化,從而降低同種異體移植物的排斥,降低潛在的有害影響。本研究結(jié)果中清楚地表明,在HA轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚移植中C3,C9,CD4和B7-2等含量與對照組相比顯著降低。延長了HA轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚移植物的存活。在一些炎癥過程中,補(bǔ)體成分也是一個關(guān)鍵的因素。根據(jù)本研究中移植皮膚炎癥期的記錄和HE染色結(jié)果表明,皮膚移植后炎癥期峰值是出現(xiàn)在1-4d之間,各組間的炎性細(xì)胞浸潤有比較顯著的差異。綜上所述,HA與HC均具有免疫抑制的特性,HA與HC在體外均可以抑制補(bǔ)體的活性,降低細(xì)胞介導(dǎo)的抑制。體內(nèi)實驗結(jié)果表明,HA在轉(zhuǎn)基因皮膚移植小鼠模型的實驗中體現(xiàn)了比較重要的作用。與對照組相比,HA轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚移植存活時間明顯延長,表明HA在應(yīng)用于提高移植物的存活時間上可能是個不錯的選擇。今后我們將進(jìn)一步深入的研究HA、HC作為可延長供體器官生存的基因治療或藥物的潛力。
【關(guān)鍵詞】：皮蠅素A(HA) 皮蠅素C(HC) 補(bǔ)體 轉(zhuǎn)基因小鼠 皮膚移植
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R617
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-13
• 符號說明13-14
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述14-26
• 第一章 皮蠅素概述14-16
• 1 皮蠅生活史簡述14
• 2 皮蠅素分類及其生物學(xué)特性14-15
• 3 小結(jié)15-16
• 第二章 皮蠅素A、C的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制16-20
• 1 寄生蟲免疫逃避機(jī)制16-17
• 2 異種移植器官“寄生蟲化”為解決移植排斥反應(yīng)提供新途徑17-18
• 3 小結(jié)18-20
• 第三章 補(bǔ)體系統(tǒng)在異種器官移植中的免疫調(diào)節(jié)作用20-23
• 1 補(bǔ)體系統(tǒng)概述20
• 2 補(bǔ)體系統(tǒng)在異種器官移植中的作用20-21
• 3 小結(jié)21-23
• 第四章 轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)研究進(jìn)展23-25
• 1 轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型的構(gòu)建方法23-24
• 2 轉(zhuǎn)基因小鼠在免疫學(xué)及異種移植研究中的應(yīng)用24
• 3 小結(jié)24-25
• 本研究的目的和意義25-26
• 第二部分 試驗研究26-82
• 第一章 皮蠅素A、C基因克隆及分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建26-42
• 1 材料26-29
• 1.1 實驗動物26
• 1.2 試劑26-27
• 1.3 儀器27
• 1.4 溶液的配制27-29
• 2. 方法29-36
• 2.1 DNA提取29
• 2.2 引物設(shè)計及PCR擴(kuò)增29-31
• 2.3 RNA的提取31-32
• 2.4 總RNA中DNA的消除32
• 2.5 RT-PCR32-33
• 2.6 重組真核表達(dá)載體pEF1α-HA-AcGFP和pEF1α-HC-AcGFP的構(gòu)建與鑒定33-36
• 3 結(jié)果36-40
• 3.1. HA基因的cDNA序列擴(kuò)增36
• 3.2 HA真核表達(dá)載體的鑒定36-37
• 3.3. HC基因的cDNA序列擴(kuò)增37-40
• 4 討論40-42
• 第二章 皮蠅素A抗體的制備及鑒定42-47
• 1. 主要材料42
• 2. 方法42-44
• 2.1 生物學(xué)分析及多肽的設(shè)計42-43
• 2.2 多肽的合成及載體的偶聯(lián)43
• 2.3 抗HA多肽抗體的制備43
• 2.4 ELISA檢測多克隆抗體的效價43
• 2.5 Western blotting分析抗血清和多克隆抗體的特異性43-44
• 3. 結(jié)果44-46
• 3.1 采用生物信息方法預(yù)測多肽序列44-45
• 3.2 抗血清或多克隆抗體效價45
• 3.3 Western印跡檢測HA抗體特異性45-46
• 4. 討論46-47
• 第三章 皮蠅素轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染47-61
• 1 材料47-48
• 1.1 實驗動物和細(xì)胞47
• 1.2 主要試劑與儀器47-48
• 2 方法48-53
• 2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代和凍存48-50
• 2.2 細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染50
• 2.3 HA、HC Cos7細(xì)胞穩(wěn)定株的篩選50
• 2.4 免疫共沉淀CO-IP50-51
• 2.5 western blot檢測51
• 2.6 EMSA實驗51-52
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)處理52-53
• 3 結(jié)果53-60
• 3.1 RT-PCR檢測53
• 3.2 pEF1α-CD-HA-GFP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞53-54
• 3.3 Western-blot檢測外源性HA在cos7細(xì)胞中的表達(dá)54
• 3.4 免疫共沉淀檢測HA與補(bǔ)體C354
• 3.5 Western blot和ELISA測定HA降解C354-55
• 3.6 EMSA實驗檢測HA與C3結(jié)合位點55-57
• 3.7 pEF1α-CD-HC-GFP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞57
• 3.8 western blot和ELISA測定HC與C3之間的作用57-58
• 3.9 設(shè)計生物素探針,應(yīng)用EMSA方法,證實HC與補(bǔ)體C3結(jié)合位點(S229,G230,A231)58-60
• 4 討論60-61
• 第四章 皮蠅素A、皮蠅素C轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立61-71
• 1 主要材料儀器61-62
• 1.1 主要儀器61
• 1.2 材料與試劑61-62
• 2 方法62-66
• 2.1 注射用線性化載體DNA的制備62
• 2.2 pEFl a -CD-HA-GFP和pEF1 a -CD-HC-GFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體酶切62
• 2.3 瓊脂糖膠檢測酶切產(chǎn)物62-63
• 2.4 割膠回收63
• 2.5 受精卵準(zhǔn)備63
• 2.6 雄性FVB和C57BL小鼠的輸精管結(jié)扎63
• 2.7 假孕母鼠制備63-64
• 2.8 受精卵微顯微注射線性化的目的基因64
• 2.9 輸卵管內(nèi)受精卵移植64
• 2.10 首建鼠的鑒定64-65
• 2.11 pEF1α-CD-HA-GFP和pEF1α-CD-HC-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代及鑒定65
• 2.12 pEF1α-CD-HA-GFP目的蛋白的表達(dá)分析65-66
• 3 結(jié)果66-69
• 3.1 pEF1α-CD-HA-GFP轉(zhuǎn)基因首建鼠鑒定結(jié)果66
• 3.2 pEF1α-CD-HC-GFP轉(zhuǎn)基因首建鼠鑒定結(jié)果66-68
• 3.3 pEF1α-CD-HA-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠F1代PCR鑒定結(jié)果68-69
• 4 討論69-71
• 第五章 皮蠅素A轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚移植、抑制移植排斥研究71-82
• 1 主要材料71-72
• 1.1 主要實驗動物和試劑71
• 1.2 溶液的配制71-72
• 2 方法72-75
• 3 結(jié)果75-80
• 3.1 皮膚免疫組化75-77
• 3.2 皮膚移植后C3,C9,CD4,B7-2、MHC Ⅱ的Western-blot檢測77-79
• 3.3 HE染色79-80
• 4 討論80-82
• 全文結(jié)論82-83
• 參考文獻(xiàn)83-92
• 致謝92-93
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文、課題及成果93-94

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  本文關(guān)鍵詞：皮蠅素轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及其抑制皮膚移植排斥的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：453982