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RPS15A通過(guò)AKT調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移的體內(nèi)和體外研究

發(fā)布時(shí)間:2017-06-16 02:07

  本文關(guān)鍵詞:RPS15A通過(guò)AKT調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移的體內(nèi)和體外研究,,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


【摘要】:目的:本實(shí)驗(yàn)旨在探究RPS15A基因與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移及成瘤有無(wú)相關(guān)性,以及與相關(guān)信號(hào)通路和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白作用的分子機(jī)制,為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷和預(yù)后提供一個(gè)新的生物學(xué)標(biāo)志物并為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因靶向治療提供新思路。方法:采集膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床腫瘤組織樣本,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RPS15A在腫瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)差異,用免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RPS15A在腫瘤樣本中的表達(dá)量;在體外實(shí)驗(yàn)中,我們選用人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,通過(guò)慢病毒感染U87細(xì)胞建立shRPS15A基因低表達(dá)細(xì)胞株,用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)證明慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的成功建立;采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PLV-Ctr細(xì)胞和敲低RPS15A基因后U87細(xì)胞的細(xì)胞存活率;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PLV-Ctr細(xì)胞和敲低RPS15A基因后U87細(xì)胞的細(xì)胞周期,從而觀察RPS15A基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87的細(xì)胞周期的影響;通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察RPS15A基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87遷移情況的影響;通過(guò)Boyden小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PLV-Ctr細(xì)胞和敲低RPS15A基因后U87細(xì)胞中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)情況從而明確RPS15A基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87遷移的影響;在體內(nèi)試驗(yàn)中,通過(guò)建立裸鼠種植瘤模型,我們觀測(cè)了RPS15A基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞裸鼠種植瘤成瘤時(shí)間和大小的影響,通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RPS15A基因在裸鼠種植瘤的腫瘤組織中的表達(dá)情況,進(jìn)而從病理和組織學(xué)的角度考察RPS15A基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞的體內(nèi)成瘤的作用;我們還通過(guò)Western blot檢測(cè)RPS15A基因?qū)?xì)胞周期蛋白P18INK4C和CDK4及磷酸化AKT的表達(dá)的影響以證實(shí)在RPS15A基因與AKT信號(hào)通路的關(guān)聯(lián),并通過(guò)AKT信號(hào)通路的的介導(dǎo)調(diào)控周期蛋白,明確RPS15A基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用靶點(diǎn)。結(jié)果:在本研究中,我們通過(guò)Q-rtPCR和VWestern blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床樣本中RPS15A基因的表達(dá),結(jié)果表明相比于正常腦組織,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中RPS15A基因的mRNA及蛋白表達(dá)增高。同樣的,我們通過(guò)免疫組化檢測(cè)RPS15A基因在臨床腫瘤樣本中的表達(dá)情況,并分別從年齡、性別、組織分型及世界衛(wèi)生組織的分期評(píng)價(jià)RPS15A基因的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)患者年齡大于50歲時(shí),高表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為43例,占樣本數(shù)的71.7%,低表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為17例,占樣本數(shù)的28.3%;而患者年齡小于50歲時(shí),高表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為47例,占樣本數(shù)的74.6%,低表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為16例,占樣本數(shù)的25.4%;在男性患者中,高表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為32例,占樣本數(shù)的64%,低表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為18例,占樣本數(shù)的36%;在女性患者中,高表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為58例,占樣本數(shù)的79.5%,低表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為15例,占樣本數(shù)的20.5%;在相關(guān)的組織學(xué)類型的調(diào)查中顯示,在星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤中,高表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為9例,占樣本數(shù)的64.3%,低表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為5例,占樣本數(shù)的35.7%;在少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤中,高表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為6例,占樣本數(shù)的66.7%,低表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為3例,占樣本數(shù)的33.3%;在間變星型細(xì)胞瘤中,高表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為47例,占樣本數(shù)的78.3%,低表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為13例,占樣本數(shù)的21.7%;在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,高表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為30例,占樣本數(shù)的75%,低表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為10例,占樣本數(shù)的25%;在WHO分期為Ⅰ和Ⅱ期的膠質(zhì)細(xì)胞瘤中,高表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為8例,占樣本數(shù)的34.8%,低表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為15例,占樣本數(shù)的65.2%;在WHO分期為Ⅲ和Ⅳ期的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,高表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為84例,占樣本數(shù)的84%,低表達(dá)RPS15A基因的例數(shù)為16例,占樣本數(shù)的16%。綜上所述,與正常腦組織對(duì)比,RPS15A基因的表達(dá)量在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中明顯增高,并且通過(guò)臨床病例的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),在WHO分期Ⅲ和Ⅳ期的膠質(zhì)細(xì)胞瘤中,RPS15A基因的表達(dá)顯著增高,說(shuō)明在惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)展過(guò)程中,RPS15A基因可能扮演著重要的作用。另外,我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征和患者預(yù)后情況與RPS15A基因之間的可能存在相關(guān)性,高表達(dá)RPS15A基因的患者的預(yù)后相比于低表達(dá)RPS15A基因的患者的預(yù)后更差,這更加證明了RPS15A基因可以作為判斷患者預(yù)后的生物標(biāo)志物之一。體外實(shí)驗(yàn)中,我們首先在U87細(xì)胞中建立了由慢病毒介導(dǎo)的sh-RPS15A基因敲低細(xì)胞模型,并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR證明了sh-RPS15A基因敲低細(xì)胞模型建立成功;我們通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活率,與PLV-Ctr細(xì)胞相比,敲低RPS15A基因的U87細(xì)胞的存活率明顯增高。我們通過(guò)細(xì)胞流式技術(shù)對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示與PLV-CTR組相比,敲低RPS15A基因的U87細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生變化,主要表現(xiàn)為G0/G1期阻滯;在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)與PLV-Ctr細(xì)胞相比,敲低RPS15A基因的U87細(xì)胞的遷移速度和數(shù)量明顯下降;在Boyden小室實(shí)驗(yàn)中,我們同樣發(fā)現(xiàn)與PLV-Ctr細(xì)胞相比,敲低RPS15A基因后U87細(xì)胞的遷移速度和數(shù)量明顯下降;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,與PLV-Ctr細(xì)胞相比,敲低RPS15A基因的U87細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖抑制,裸鼠荷瘤的體積顯著減小,RPS15A基因表達(dá)降低可以顯著減緩腫瘤的成瘤進(jìn)程;在對(duì)機(jī)制的探討方面,主要對(duì)細(xì)胞周期蛋白和AKT信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PLV-Ctr細(xì)胞相比,敲低RPS15A基因的U87細(xì)胞中P18INK4C表達(dá)增加,而CDK4的表達(dá)的明顯減少;與PLV-Ctr細(xì)胞相比,敲低RPS15A基因的U87細(xì)胞中磷酸化AKT的表達(dá)減少,進(jìn)而說(shuō)明RPS15A通過(guò)對(duì)磷酸化AKT的調(diào)控影響U87細(xì)胞的體內(nèi)及體外增殖。結(jié)論:RPS15A基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床樣本中表達(dá)顯著上調(diào),RPS15A基因可能存在靶基因AKT,即AKT信號(hào)通路可能與RPS15A基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的癌基因作用相關(guān),下調(diào)RPS15A基因的表達(dá)可以抑制磷酸化AKT的活性,抑制U87細(xì)胞體外增殖、遷移以及體內(nèi)成瘤,AKT可能是RPS15A基因的作用靶點(diǎn),我們的研究結(jié)果為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷和預(yù)后提供了新的生物學(xué)標(biāo)志物,并為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因靶向治療提供了新依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 RPS15A AKT
【學(xué)位授予單位】:大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號(hào)】:R739.4
【目錄】:
  • 中文摘要7-10
  • 英文摘要10-14
  • 前言14-17
  • 引言17-20
  • 材料與方法20-45
  • 1. 材料20-27
  • 1.1 藥品與試劑20-21
  • 1.2 儀器21-23
  • 1.3 臨床病例、動(dòng)物和細(xì)胞23
  • 1.4 主要溶液的配制23-27
  • 2. 實(shí)驗(yàn)方法27-45
  • 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)27-28
  • 2.2 病毒感染目的細(xì)胞28-34
  • 2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)34
  • 2.4 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)34-35
  • 2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)35-36
  • 2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)36
  • 2.7 裸鼠移植模型建立36-37
  • 2.8 腫瘤組織病理學(xué)檢測(cè)37-38
  • 2.9 病理免疫組化38-39
  • 2.10 QRT-PCR實(shí)驗(yàn)39-42
  • 2.11 Western Blot實(shí)驗(yàn)42-45
  • 2.12 數(shù)據(jù)處理45
  • 結(jié)果45-56
  • 1. RPS15A基因在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常腦組織45-47
  • 2. 膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存時(shí)間與RPS15A基因表達(dá)密切相關(guān)47-50
  • 3. U87細(xì)胞Sh-RPS15A穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系驗(yàn)證50-51
  • 4. RPS15A基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響51
  • 5. RPS15A基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移的影響51-53
  • 6. RPS15A基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的影響53
  • 7. RPS15A基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響53-54
  • 8. RPS15A基因?qū)α姿峄疉KT表達(dá)的影響54-55
  • 9. RPS15A基因?qū)β闶蠓N植瘤增殖的影響55-56
  • 討論56-60
  • 結(jié)論60
  • 參考文獻(xiàn)60-72
  • 綜述72-90
  • 參考文獻(xiàn)83-90
  • 致謝90

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉婷婷;AQP4在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)展中的作用[D];安徽大學(xué);2016年

2 杜池剛;擴(kuò)散因子受體對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)影響的相關(guān)研究[D];山東大學(xué);2009年

3 馬揚(yáng);膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者術(shù)前預(yù)后評(píng)分的研究[D];山東大學(xué);2012年

4 許豪;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后放化療與單純手術(shù)治療方案的療效觀察[D];山東大學(xué);2014年

5 郭欣茹;腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血漿差異蛋白質(zhì)分析[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2014年

6 王宗寶;秋水仙堿對(duì)小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤化療初步研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2008年

7 師惠;人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中白藜蘆醇代謝產(chǎn)物及其代謝相關(guān)酶表達(dá)的分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

8 淦作松;三氧化二砷誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡作用的研究[D];江西醫(yī)學(xué)院;2004年

9 趙朝輝;人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中NFKBIA多態(tài)性的分析研究[D];蘇州大學(xué);2014年

10 時(shí)光;老年膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者規(guī)范化治療療效及安全性分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2014年


  本文關(guān)鍵詞:RPS15A通過(guò)AKT調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移的體內(nèi)和體外研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。



本文編號(hào):454092

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