細(xì)胞自噬可以維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡,在細(xì)胞的生長發(fā)育過程中起重要作用。細(xì)胞自噬與惡性黑色素瘤的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。但目前的研究顯示黑色素瘤發(fā)生發(fā)展和自噬之間的關(guān)系相互矛盾。一方面,自噬能抑制BRAFV600E驅(qū)動的腫瘤發(fā)生;另一方面,自噬能促進(jìn)黑色素瘤的生長。這一悖論至今尚未解決,而且細(xì)胞自噬對黑色素瘤生長控制的具體分子機(jī)制并不清楚。BRAFV600E基因突變是黑色素瘤最常見的遺傳改變。盡管BRAFV600E和自噬之間的關(guān)系一直模糊不清,但是BRAFV600E抑制劑（BRAFi）治療的黑色素瘤患者體內(nèi)細(xì)胞自噬水平顯著增高。目前關(guān)于BRAFi誘導(dǎo)黑色素瘤產(chǎn)生自噬的幾種可能的機(jī)制都不能很好地解釋致癌BRAF信號傳導(dǎo)與自噬之間的內(nèi)在聯(lián)系。因此,BRAFi誘導(dǎo)自噬的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。另外,細(xì)胞自噬是黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵機(jī)制,自噬可能作為一種應(yīng)激逃避機(jī)制導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。但是目前關(guān)于黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的具體機(jī)制并不清楚。因此,本文旨在研究BRAFV600E黑色素瘤中BRAFi激活自噬-溶酶體的具體分子機(jī)制以及該途徑對致癌信號傳導(dǎo)和惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥性的作用和影響... 

【文章頁數(shù)】：224 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮略詞對照表
1 緒論
    1.1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.1.1 細(xì)胞自噬
        1.1.2 惡性黑色素瘤和BRAF
        1.1.3 轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)與ZKSCAN3
    1.2 問題的提出和研究意義
    1.3 研究目的與研究內(nèi)容
        1.3.1 研究目的
        1.3.2 研究內(nèi)容
        1.3.3 技術(shù)路線
    1.4 創(chuàng)新性
2 抑制BRAF~(V600)E可以通過TFEB誘導(dǎo)自噬-溶酶體激活
    2.1 引言
    2.2 實驗儀器、材料與試劑
        2.2.1 實驗儀器
        2.2.2 實驗材料與試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        2.3.2 質(zhì)粒的大量抽提
        2.3.3 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染
        2.3.4 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        2.3.5 自噬誘導(dǎo)分析
        2.3.6 實時定量PCR檢測
        2.3.7 Western Blot檢測目的蛋白表達(dá)
        2.3.8 免疫熒光染色
        2.3.9 GSEA基因富集分析
        2.3.10 β-N-乙酞氨基葡萄糖普酶(NAG)活性測定
        2.3.11 Lyso-tracker Red DND-99探針檢測溶酶體
        2.3.12 數(shù)據(jù)處理
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 PLX4720誘導(dǎo)細(xì)胞自噬
        2.4.2 PLX4720誘導(dǎo)細(xì)胞溶酶體功能激活
        2.4.3 PLX4720誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以及溶酶體激活依賴于TFEB
    2.5 討論
    2.6 本章小結(jié)
3 BRAF~(V600E)細(xì)胞中PLX4720通過抑制ERK來活化TFEB
    3.1 引言
    3.2 實驗儀器、材料與試劑
        3.2.1 實驗儀器
        3.2.2 實驗材料與試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        3.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.3 質(zhì)粒的大量抽提
        3.3.4 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染
        3.3.5 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        3.3.6 PLX4720或其他藥物誘導(dǎo)
        3.3.7 Western Blot檢測目的蛋白表達(dá)
        3.3.8 免疫熒光染色
        3.3.9 細(xì)胞核質(zhì)分離
        3.3.10 蛋白免疫共沉淀
        3.3.11 GFP-Trap beads檢測GFP蛋白
        3.3.12 數(shù)據(jù)處理
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 PLX4720在BRAF~(V600E)細(xì)胞中誘導(dǎo)TFEB的細(xì)胞核易位
        3.4.2 PLX4720導(dǎo)致TFEB去磷酸化并失去與14-3-3蛋白的相互作用
        3.4.3 PLX4720通過抑制ERK激活TFEB
    3.5 討論
    3.6 本章小結(jié)
4 ERK招募TFEB于溶酶體上直接磷酸化S142位點
    4.1 引言
    4.2 實驗儀器、材料與試劑
        4.2.1 實驗儀器
        4.2.2 實驗材料與試劑
    4.3 實驗方法
        4.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        4.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        4.3.3 定點基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        4.3.5 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染
        4.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        4.3.7 PLX4720或其他藥物誘導(dǎo)
        4.3.8 Western Blot檢測目的蛋白表達(dá)
        4.3.9 免疫熒光染色
        4.3.10 BL21感受態(tài)細(xì)胞的制作
        4.3.11 GST融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        4.3.12 蛋白激酶體外測定實驗
        4.3.13 蛋白免疫共沉淀
        4.3.14 GFP-Trap beads檢測GFP蛋白
        4.3.15 Lyso-tracker Red DND-99探針檢測溶酶體
        4.3.16 數(shù)據(jù)處理
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 在BRAF~(V600E)細(xì)胞中ERK與TFEB共定位于溶酶體
        4.4.2 BRAF~(V600E)細(xì)胞中ERK直接磷酸化TFEB Ser142介導(dǎo)其活性調(diào)控
        4.4.3 ERK介導(dǎo)的TFEB-溶酶體結(jié)合和S142磷酸化過程不依賴于mTORC1
        4.4.4 ERK介導(dǎo)S142磷酸化促進(jìn)TFEB與14-3-3相互作用
        4.4.5 ERK介導(dǎo)的TFEB S142磷酸化構(gòu)成了PLX4720誘導(dǎo)的黑色素瘤自噬-溶酶體激活的主要機(jī)制
    4.5 討論
    4.6 本章小結(jié)
5 BRAFi通過JNK2/p38 MAPK磷酸化ZKSCAN3 Thr153介導(dǎo)其細(xì)胞質(zhì)易位和失活來協(xié)同TFEB激活自噬-溶酶體
    5.1 引言
    5.2 實驗儀器、材料與試劑
        5.2.1 實驗儀器
        5.2.2 實驗材料與試劑
    5.3 實驗方法
        5.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        5.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        5.3.3 質(zhì)粒的大量抽提
        5.3.4 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染
        5.3.5 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        5.3.6 PLX4720或其他藥物誘導(dǎo)
        5.3.7 Western Blot檢測目的蛋白表達(dá)
        5.3.8 免疫熒光染色
        5.3.9 細(xì)胞核質(zhì)分離
        5.3.10 定點基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.3.11 Lyso-tracker Red DND-99探針檢測溶酶體
        5.3.12 數(shù)據(jù)處理
    5.4 實驗結(jié)果
        5.4.1 在BRAF~(V600E)細(xì)胞中PLX4720誘導(dǎo)ZKSCAN3的細(xì)胞質(zhì)易位
        5.4.2 PLX4720通過JNK2/p38 MAPK調(diào)控ZKSCAN3的細(xì)胞質(zhì)易位
        5.4.3 JNK2/p38 MAPK磷酸化ZKSCAN3 T153調(diào)控其細(xì)胞質(zhì)易位
        5.4.4 ZKSCAN3~(T153A) PLX4720誘導(dǎo)的自噬-溶酶體生物發(fā)生具有拮抗作用
    5.5 討論
    5.6 本章小結(jié)
6 TFEB/ZKSCAN3介導(dǎo)的自噬-溶酶體轉(zhuǎn)錄抑制促進(jìn)黑色素瘤惡化、侵襲和增殖
    6.1 引言
    6.2 實驗儀器、材料與試劑
        6.2.1 實驗儀器
        6.2.2 實驗材料與試劑
    6.3 實驗方法
        6.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        6.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        6.3.3 定點基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        6.3.5 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染
        6.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        6.3.7 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和穩(wěn)定株的構(gòu)建
        6.3.8 Western Blot檢測目的蛋白表達(dá)
        6.3.9 NOD/SCID小鼠實驗
        6.3.10 細(xì)胞集落形成實驗
        6.3.11 掃描電子顯微鏡分析
        6.3.12 免疫組織化學(xué)分析
        6.3.13 數(shù)據(jù)處理
    6.4 實驗結(jié)果
        6.4.1 TFEB介導(dǎo)的自噬-溶酶體激活能抑制BRAF~(V600E)驅(qū)動的黑色素瘤發(fā)生發(fā)展
        6.4.2 TFEB S142磷酸化介導(dǎo)的自噬-溶酶體轉(zhuǎn)錄抑制有助于腫瘤惡化、侵襲和增殖
        6.4.3 ZKCAN3的沉默與TFEB表達(dá)協(xié)同抑制BRAF~(V600E)驅(qū)動的黑色素瘤發(fā)生發(fā)展
    6.5 討論
    6.6 本章小結(jié)
7 TFEB S142磷酸化介導(dǎo)的自噬-溶酶體失活通過抑制TGF-β蛋白降解來激活TGF-β和EMT信號傳導(dǎo)
    7.1 引言
    7.2 實驗儀器、材料與試劑
        7.2.1 實驗儀器
        7.2.2 實驗材料與試劑
    7.3 實驗方法
        7.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        7.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        7.3.3 定點基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        7.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        7.3.5 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染
        7.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        7.3.7 實時定量PCR檢測
        7.3.8 Western Blot檢測目的蛋白表達(dá)
        7.3.9 免疫熒光染色
        7.3.10 蛋白免疫共沉淀
        7.3.11 BL21感受態(tài)細(xì)胞的制作
        7.3.12 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        7.3.13 蛋白體外相互作用測定實驗
        7.3.14 Pulldown檢測蛋白相互作用
        7.3.15 高通量RNA測序(RNA-seq)
        7.3.16 GSEA基因富集分析
        7.3.17 藥物誘導(dǎo)
        7.3.18 數(shù)據(jù)處理
    7.4 實驗結(jié)果
        7.4.1 TFEB S142磷酸化和由此產(chǎn)生的自噬-溶酶體轉(zhuǎn)錄抑制降低腫瘤分化
        7.4.2 TFEB S142磷酸化促進(jìn)TGF-β信號傳導(dǎo)的活化和EMT的激活
        7.4.3 TFEB S142磷酸化引起的自噬-溶酶體失活抑制TGF-β蛋白降解
        7.4.4 自噬蛋白LC3與pro-TGF-β直接相互作用調(diào)控TGF-β蛋白降解
    7.5 討論
    7.6 本章小結(jié)
8 TFEB S142磷酸化促進(jìn)BRAF~(V600E)黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移
    8.1 引言
    8.2 實驗儀器、材料與試劑
        8.2.1 實驗儀器
        8.2.2 實驗材料與試劑
    8.3 實驗方法
        8.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        8.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        8.3.3 定點基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        8.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        8.3.5 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染
        8.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        8.3.7 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和穩(wěn)定株的構(gòu)建
        8.3.8 Western Blot檢測目的蛋白表達(dá)
        8.3.9 C57B1/6J小鼠實驗
        8.3.10 免疫熒光染色
        8.3.11 Lyso-tracker Red DND-99探針檢測溶酶體
        8.3.12 免疫組織化學(xué)分析
        8.3.13 數(shù)據(jù)處理
    8.4 實驗結(jié)果
        8.4.1 TFEB S142磷酸化對表達(dá)BRAF~(V600E)的B16-F10黑色素瘤細(xì)胞中自噬和溶酶體生物發(fā)生具有抑制作用
        8.4.2 TFEB S142磷酸化促進(jìn)BRAF~(V600E)黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移
    8.5 討論
    8.6 本章小結(jié)
9 TFEB S142磷酸化介導(dǎo)的自噬-溶酶體失活在耐藥性BRAF~(V600E)黑色素瘤中促進(jìn)腫瘤惡化、侵襲和增殖
    9.1 引言
    9.2 實驗儀器、材料與試劑
        9.2.1 實驗儀器
        9.2.2 實驗材料與試劑
    9.3 實驗方法
        9.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        9.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        9.3.3 定點基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        9.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        9.3.5 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染
        9.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        9.3.7 細(xì)胞集落形成實驗
        9.3.8 Western Blot檢測目的蛋白表達(dá)
        9.3.9 NOD/SCID小鼠實驗
        9.3.10 免疫熒光染色
        9.3.11 藥物誘導(dǎo)
        9.3.12 免疫組織化學(xué)分析
        9.3.13 數(shù)據(jù)處理
    9.4 實驗結(jié)果
        9.4.1 A375~R細(xì)胞對PLX4720不敏感
        9.4.2 TFEB S142磷酸化在BRAFi不敏感的BRAF~(V600E)黑色素瘤中促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展
    9.5 討論
    9.6 本章小結(jié)
10 TFEB S142磷酸化介導(dǎo)的自噬-溶酶體抑制賦予黑色素瘤耐藥性并促進(jìn)TGF-β和EMT信號傳導(dǎo)和腫瘤肉瘤樣變
    10.1 引言
    10.2 實驗儀器、材料與試劑
        10.2.1 實驗儀器
        10.2.2 實驗材料與試劑
    10.3 實驗方法
        10.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        10.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        10.3.3 定點基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        10.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        10.3.5 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染
        10.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        10.3.7 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和穩(wěn)定株的構(gòu)建
        10.3.8 細(xì)胞集落形成實驗
        10.3.9 Western Blot檢測目的蛋白表達(dá)
        10.3.10 NOD/SCID小鼠實驗
        10.3.11 免疫熒光染色
        10.3.12 藥物誘導(dǎo)
        10.3.13 免疫組織化學(xué)分析
        10.3.14 數(shù)據(jù)處理
    10.4 實驗結(jié)果
        10.4.1 TFEB S142磷酸化賦予黑色素瘤細(xì)胞對BRAFi的耐藥性
        10.4.2 TFEB S142磷酸化抑制了PLX4720對黑色素瘤的治療效果
        10.4.3 TFEB S142磷酸化促進(jìn)原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中TGF-β和EMT信號傳導(dǎo)水平并同時抑制腫瘤分化引起肉瘤樣變
        10.4.4 TGF-β受體抑制劑(TGF-βRi)與BRAFi協(xié)同作用使表達(dá)TFEB~(S142E)的細(xì)胞對BRAFi重新敏感
    10.5 討論
    10.6 本章小結(jié)
11 總結(jié)與展望
    11.1 總結(jié)
    11.2 工作展望
參考文獻(xiàn)
附錄A 作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文及申請專利情況
附錄B
    A. 本文中RNA-seq及GSEA分析原始結(jié)果
    B. 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集
致謝



本文編號：3726832