細(xì)胞自噬可以維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡,在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。細(xì)胞自噬與惡性黑色素瘤的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。但目前的研究顯示黑色素瘤發(fā)生發(fā)展和自噬之間的關(guān)系相互矛盾。一方面,自噬能抑制BRAFV600E驅(qū)動(dòng)的腫瘤發(fā)生;另一方面,自噬能促進(jìn)黑色素瘤的生長(zhǎng)。這一悖論至今尚未解決,而且細(xì)胞自噬對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)控制的具體分子機(jī)制并不清楚。BRAFV600E基因突變是黑色素瘤最常見(jiàn)的遺傳改變。盡管BRAFV600E和自噬之間的關(guān)系一直模糊不清,但是BRAFV600E抑制劑（BRAFi）治療的黑色素瘤患者體內(nèi)細(xì)胞自噬水平顯著增高。目前關(guān)于BRAFi誘導(dǎo)黑色素瘤產(chǎn)生自噬的幾種可能的機(jī)制都不能很好地解釋致癌BRAF信號(hào)傳導(dǎo)與自噬之間的內(nèi)在聯(lián)系。因此,BRAFi誘導(dǎo)自噬的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。另外,細(xì)胞自噬是黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵機(jī)制,自噬可能作為一種應(yīng)激逃避機(jī)制導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。但是目前關(guān)于黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的具體機(jī)制并不清楚。因此,本文旨在研究BRAFV600E黑色素瘤中BRAFi激活自噬-溶酶體的具體分子機(jī)制以及該途徑對(duì)致癌信號(hào)傳導(dǎo)和惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥性的作用和影響... 

【文章頁(yè)數(shù)】：224 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮略詞對(duì)照表
1 緒論
    1.1 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.1.1 細(xì)胞自噬
        1.1.2 惡性黑色素瘤和BRAF
        1.1.3 轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)與ZKSCAN3
    1.2 問(wèn)題的提出和研究意義
    1.3 研究目的與研究?jī)?nèi)容
        1.3.1 研究目的
        1.3.2 研究?jī)?nèi)容
        1.3.3 技術(shù)路線
    1.4 創(chuàng)新性
2 抑制BRAF~(V600)E可以通過(guò)TFEB誘導(dǎo)自噬-溶酶體激活
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        2.3.2 質(zhì)粒的大量抽提
        2.3.3 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        2.3.4 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        2.3.5 自噬誘導(dǎo)分析
        2.3.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
        2.3.7 Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)
        2.3.8 免疫熒光染色
        2.3.9 GSEA基因富集分析
        2.3.10 β-N-乙酞氨基葡萄糖普酶(NAG)活性測(cè)定
        2.3.11 Lyso-tracker Red DND-99探針檢測(cè)溶酶體
        2.3.12 數(shù)據(jù)處理
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 PLX4720誘導(dǎo)細(xì)胞自噬
        2.4.2 PLX4720誘導(dǎo)細(xì)胞溶酶體功能激活
        2.4.3 PLX4720誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以及溶酶體激活依賴于TFEB
    2.5 討論
    2.6 本章小結(jié)
3 BRAF~(V600E)細(xì)胞中PLX4720通過(guò)抑制ERK來(lái)活化TFEB
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        3.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.3 質(zhì)粒的大量抽提
        3.3.4 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        3.3.5 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        3.3.6 PLX4720或其他藥物誘導(dǎo)
        3.3.7 Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)
        3.3.8 免疫熒光染色
        3.3.9 細(xì)胞核質(zhì)分離
        3.3.10 蛋白免疫共沉淀
        3.3.11 GFP-Trap beads檢測(cè)GFP蛋白
        3.3.12 數(shù)據(jù)處理
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 PLX4720在BRAF~(V600E)細(xì)胞中誘導(dǎo)TFEB的細(xì)胞核易位
        3.4.2 PLX4720導(dǎo)致TFEB去磷酸化并失去與14-3-3蛋白的相互作用
        3.4.3 PLX4720通過(guò)抑制ERK激活TFEB
    3.5 討論
    3.6 本章小結(jié)
4 ERK招募TFEB于溶酶體上直接磷酸化S142位點(diǎn)
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        4.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        4.3.3 定點(diǎn)基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        4.3.5 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        4.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        4.3.7 PLX4720或其他藥物誘導(dǎo)
        4.3.8 Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)
        4.3.9 免疫熒光染色
        4.3.10 BL21感受態(tài)細(xì)胞的制作
        4.3.11 GST融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        4.3.12 蛋白激酶體外測(cè)定實(shí)驗(yàn)
        4.3.13 蛋白免疫共沉淀
        4.3.14 GFP-Trap beads檢測(cè)GFP蛋白
        4.3.15 Lyso-tracker Red DND-99探針檢測(cè)溶酶體
        4.3.16 數(shù)據(jù)處理
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 在BRAF~(V600E)細(xì)胞中ERK與TFEB共定位于溶酶體
        4.4.2 BRAF~(V600E)細(xì)胞中ERK直接磷酸化TFEB Ser142介導(dǎo)其活性調(diào)控
        4.4.3 ERK介導(dǎo)的TFEB-溶酶體結(jié)合和S142磷酸化過(guò)程不依賴于mTORC1
        4.4.4 ERK介導(dǎo)S142磷酸化促進(jìn)TFEB與14-3-3相互作用
        4.4.5 ERK介導(dǎo)的TFEB S142磷酸化構(gòu)成了PLX4720誘導(dǎo)的黑色素瘤自噬-溶酶體激活的主要機(jī)制
    4.5 討論
    4.6 本章小結(jié)
5 BRAFi通過(guò)JNK2/p38 MAPK磷酸化ZKSCAN3 Thr153介導(dǎo)其細(xì)胞質(zhì)易位和失活來(lái)協(xié)同TFEB激活自噬-溶酶體
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        5.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        5.3.3 質(zhì)粒的大量抽提
        5.3.4 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        5.3.5 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        5.3.6 PLX4720或其他藥物誘導(dǎo)
        5.3.7 Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)
        5.3.8 免疫熒光染色
        5.3.9 細(xì)胞核質(zhì)分離
        5.3.10 定點(diǎn)基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.3.11 Lyso-tracker Red DND-99探針檢測(cè)溶酶體
        5.3.12 數(shù)據(jù)處理
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.1 在BRAF~(V600E)細(xì)胞中PLX4720誘導(dǎo)ZKSCAN3的細(xì)胞質(zhì)易位
        5.4.2 PLX4720通過(guò)JNK2/p38 MAPK調(diào)控ZKSCAN3的細(xì)胞質(zhì)易位
        5.4.3 JNK2/p38 MAPK磷酸化ZKSCAN3 T153調(diào)控其細(xì)胞質(zhì)易位
        5.4.4 ZKSCAN3~(T153A) PLX4720誘導(dǎo)的自噬-溶酶體生物發(fā)生具有拮抗作用
    5.5 討論
    5.6 本章小結(jié)
6 TFEB/ZKSCAN3介導(dǎo)的自噬-溶酶體轉(zhuǎn)錄抑制促進(jìn)黑色素瘤惡化、侵襲和增殖
    6.1 引言
    6.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    6.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        6.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        6.3.3 定點(diǎn)基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        6.3.5 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        6.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        6.3.7 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和穩(wěn)定株的構(gòu)建
        6.3.8 Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)
        6.3.9 NOD/SCID小鼠實(shí)驗(yàn)
        6.3.10 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)
        6.3.11 掃描電子顯微鏡分析
        6.3.12 免疫組織化學(xué)分析
        6.3.13 數(shù)據(jù)處理
    6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.4.1 TFEB介導(dǎo)的自噬-溶酶體激活能抑制BRAF~(V600E)驅(qū)動(dòng)的黑色素瘤發(fā)生發(fā)展
        6.4.2 TFEB S142磷酸化介導(dǎo)的自噬-溶酶體轉(zhuǎn)錄抑制有助于腫瘤惡化、侵襲和增殖
        6.4.3 ZKCAN3的沉默與TFEB表達(dá)協(xié)同抑制BRAF~(V600E)驅(qū)動(dòng)的黑色素瘤發(fā)生發(fā)展
    6.5 討論
    6.6 本章小結(jié)
7 TFEB S142磷酸化介導(dǎo)的自噬-溶酶體失活通過(guò)抑制TGF-β蛋白降解來(lái)激活TGF-β和EMT信號(hào)傳導(dǎo)
    7.1 引言
    7.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        7.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        7.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    7.3 實(shí)驗(yàn)方法
        7.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        7.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        7.3.3 定點(diǎn)基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        7.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        7.3.5 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        7.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        7.3.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
        7.3.8 Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)
        7.3.9 免疫熒光染色
        7.3.10 蛋白免疫共沉淀
        7.3.11 BL21感受態(tài)細(xì)胞的制作
        7.3.12 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        7.3.13 蛋白體外相互作用測(cè)定實(shí)驗(yàn)
        7.3.14 Pulldown檢測(cè)蛋白相互作用
        7.3.15 高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)
        7.3.16 GSEA基因富集分析
        7.3.17 藥物誘導(dǎo)
        7.3.18 數(shù)據(jù)處理
    7.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        7.4.1 TFEB S142磷酸化和由此產(chǎn)生的自噬-溶酶體轉(zhuǎn)錄抑制降低腫瘤分化
        7.4.2 TFEB S142磷酸化促進(jìn)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的活化和EMT的激活
        7.4.3 TFEB S142磷酸化引起的自噬-溶酶體失活抑制TGF-β蛋白降解
        7.4.4 自噬蛋白LC3與pro-TGF-β直接相互作用調(diào)控TGF-β蛋白降解
    7.5 討論
    7.6 本章小結(jié)
8 TFEB S142磷酸化促進(jìn)BRAF~(V600E)黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移
    8.1 引言
    8.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        8.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        8.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    8.3 實(shí)驗(yàn)方法
        8.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        8.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        8.3.3 定點(diǎn)基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        8.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        8.3.5 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        8.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        8.3.7 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和穩(wěn)定株的構(gòu)建
        8.3.8 Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)
        8.3.9 C57B1/6J小鼠實(shí)驗(yàn)
        8.3.10 免疫熒光染色
        8.3.11 Lyso-tracker Red DND-99探針檢測(cè)溶酶體
        8.3.12 免疫組織化學(xué)分析
        8.3.13 數(shù)據(jù)處理
    8.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        8.4.1 TFEB S142磷酸化對(duì)表達(dá)BRAF~(V600E)的B16-F10黑色素瘤細(xì)胞中自噬和溶酶體生物發(fā)生具有抑制作用
        8.4.2 TFEB S142磷酸化促進(jìn)BRAF~(V600E)黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移
    8.5 討論
    8.6 本章小結(jié)
9 TFEB S142磷酸化介導(dǎo)的自噬-溶酶體失活在耐藥性BRAF~(V600E)黑色素瘤中促進(jìn)腫瘤惡化、侵襲和增殖
    9.1 引言
    9.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        9.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        9.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    9.3 實(shí)驗(yàn)方法
        9.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        9.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        9.3.3 定點(diǎn)基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        9.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        9.3.5 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        9.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        9.3.7 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)
        9.3.8 Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)
        9.3.9 NOD/SCID小鼠實(shí)驗(yàn)
        9.3.10 免疫熒光染色
        9.3.11 藥物誘導(dǎo)
        9.3.12 免疫組織化學(xué)分析
        9.3.13 數(shù)據(jù)處理
    9.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        9.4.1 A375~R細(xì)胞對(duì)PLX4720不敏感
        9.4.2 TFEB S142磷酸化在BRAFi不敏感的BRAF~(V600E)黑色素瘤中促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展
    9.5 討論
    9.6 本章小結(jié)
10 TFEB S142磷酸化介導(dǎo)的自噬-溶酶體抑制賦予黑色素瘤耐藥性并促進(jìn)TGF-β和EMT信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤肉瘤樣變
    10.1 引言
    10.2 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
        10.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        10.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    10.3 實(shí)驗(yàn)方法
        10.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        10.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建
        10.3.3 定點(diǎn)基因突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        10.3.4 質(zhì)粒的大量抽提
        10.3.5 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        10.3.6 構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)基因或shRNA的穩(wěn)定細(xì)胞株
        10.3.7 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和穩(wěn)定株的構(gòu)建
        10.3.8 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)
        10.3.9 Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)
        10.3.10 NOD/SCID小鼠實(shí)驗(yàn)
        10.3.11 免疫熒光染色
        10.3.12 藥物誘導(dǎo)
        10.3.13 免疫組織化學(xué)分析
        10.3.14 數(shù)據(jù)處理
    10.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        10.4.1 TFEB S142磷酸化賦予黑色素瘤細(xì)胞對(duì)BRAFi的耐藥性
        10.4.2 TFEB S142磷酸化抑制了PLX4720對(duì)黑色素瘤的治療效果
        10.4.3 TFEB S142磷酸化促進(jìn)原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中TGF-β和EMT信號(hào)傳導(dǎo)水平并同時(shí)抑制腫瘤分化引起肉瘤樣變
        10.4.4 TGF-β受體抑制劑(TGF-βRi)與BRAFi協(xié)同作用使表達(dá)TFEB~(S142E)的細(xì)胞對(duì)BRAFi重新敏感
    10.5 討論
    10.6 本章小結(jié)
11 總結(jié)與展望
    11.1 總結(jié)
    11.2 工作展望
參考文獻(xiàn)
附錄A 作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文及申請(qǐng)專利情況
附錄B
    A. 本文中RNA-seq及GSEA分析原始結(jié)果
    B. 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集
致謝



本文編號(hào)：3726832