本文關(guān)鍵詞：NEDD9在肝癌中的表達(dá)及其與肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性之間關(guān)系的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)的發(fā)病率逐年上升,目前,在世界范圍內(nèi),它已經(jīng)是處于第二位的癌癥致死原因,每年大約有800000的肝癌患者死亡。肝癌的根治性治療手段包括根治性肝癌切除、肝臟移植和經(jīng)皮肝癌射頻消融術(shù),除此之外的選擇性肝動(dòng)脈栓塞化療(TACE)、放射性栓塞以及系統(tǒng)的全身化療都是姑息性治療手段。在臨床工作中,醫(yī)務(wù)工作者們往往根據(jù)患者的腫瘤特征、腫瘤分期以及患者身體狀況采取個(gè)性化的治療方案。其中只有早期肝癌患者適合采取根治性治療手段,其5年生存率也相應(yīng)較高,能夠達(dá)到75%。通常來說,當(dāng)有癥狀時(shí)發(fā)現(xiàn)的肝癌往往已經(jīng)有了沿脈管系統(tǒng)的侵犯或者腫瘤體積過大,15%的肝癌患者診斷時(shí)已經(jīng)有了肝外轉(zhuǎn)移,最常見的轉(zhuǎn)移器官包括肺臟、腹腔淋巴結(jié)、骨和腎上腺,這些患者只能采取姑息性治療手段。但是無論是早期肝癌患者還是晚期肝癌患者,困擾臨床醫(yī)生的一個(gè)問題是患者在治療過程中或治療后不久就出現(xiàn)了肝內(nèi)或者其它遠(yuǎn)處臟器的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。既往的研究已經(jīng)表明,肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)包含多個(gè)關(guān)鍵分子、多條信號(hào)通路的多步驟生物學(xué)過程,在此過程中,腫瘤細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷一個(gè)多基因的變化過程,從而導(dǎo)致其增殖潛能增加,凋亡耐受以及轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)。因此,探索尋找與肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵敏感基因,從而揭示這個(gè)過程的深層次機(jī)制,對(duì)于改善肝癌的治療和預(yù)后有著重要意義。NEDD9的英文完整名稱是Neural precursor cell Expressed Developmentally Down regulated 9,在一些文獻(xiàn)里還被描述為HEF1(Human enhancer of filamentation1),另外還有一種形式是Cas-L,它的m RNA包含2505nt。很多研究都已經(jīng)把NEDD9基因定位于一個(gè)能夠決定腫瘤轉(zhuǎn)移的“開關(guān)”。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中,有一系列的異常表達(dá)基因可以作為特征性表現(xiàn),而NEDD9正是其中一員。在高侵襲的膠質(zhì)瘤中,NEDD9是前致癌基因FAK激酶的特異性效應(yīng)分子,對(duì)于腫瘤細(xì)胞的遷徙和侵襲至關(guān)重要,利用轉(zhuǎn)基因的手段下調(diào)NEDD9的表達(dá)水平能夠削弱此種細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。通過飽和性比較基因雜交的方法,在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的大基因組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),NEDD9在一個(gè)小鼠轉(zhuǎn)移性黑色素瘤動(dòng)物模型中是一個(gè)擴(kuò)增子的目標(biāo)基因,而這個(gè)擴(kuò)增子與腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。相似的研究證實(shí)在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中,NEDD9無論是在m RNA還是蛋白水平其表達(dá)量均明顯升高,即便是在沒有基因擴(kuò)增的情況下依然如此,而且這種表達(dá)量的升高與腫瘤轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)�？偟脕碚f,NEDD9在細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、生長和致癌性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著十分重要的作用。然而NEDD9也可能在不同腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程中發(fā)揮著不同的作用,典型的例子就是在一個(gè)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞系中NEDD9的表達(dá)低于正常水平,這個(gè)研究被報(bào)道在《自然》雜志。雖然NEDD9在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用是一個(gè)近期的研究熱點(diǎn),但NEDD9在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用及其調(diào)控的相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。目的:檢測NEDD9在肝癌組織中及癌旁非腫瘤肝臟組織中的表達(dá)差異,探討NEDD9的表達(dá)與肝細(xì)胞癌一系列臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系;利用基因轉(zhuǎn)染、RNA干擾等技術(shù)從體內(nèi)、外觀察上調(diào)和下調(diào)NEDD9的表達(dá)水平對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等細(xì)胞學(xué)特性的作用,評(píng)價(jià)其作為肝癌基因治療靶點(diǎn)的意義;探討NEDD9介導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的可能機(jī)制。方法:通過RT-q PCR和Western blot的方法檢測肝癌組織和癌旁非腫瘤組織中NEDD9 m RNA和蛋白水平的表達(dá);用免疫組織化學(xué)染色的手段研究肝癌組織中NEDD9的表達(dá)水平和常見臨床指標(biāo)之間的關(guān)系;NEDD9對(duì)肝癌復(fù)發(fā)和生存預(yù)后的意義通過采用生存分析的研究方法予以說明;通過基因重組的方法改變肝癌細(xì)胞中NEDD9的表達(dá)水平,并通過MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)以及Transwell小室穿膜實(shí)驗(yàn)分別分析NEDD9在體外對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。通過小鼠動(dòng)物模型研究NEDD9在體內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移能力的作用。末尾研究了NEDD9通過何種分子機(jī)制促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲。結(jié)果:1、第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明肝癌組織中NEDD9的m RNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁非腫瘤肝臟組織,此外NEDD9的表達(dá)量與腫瘤大小、腫瘤病理分化程度、有無其它臟器轉(zhuǎn)移、有無門靜脈侵犯以及腫瘤的TNM分期有關(guān)。生存分析顯示,NEDD9高表達(dá)的肝癌患者的術(shù)后無瘤生存時(shí)間以及總生存時(shí)間均明顯短于NEDD9低表達(dá)的肝癌患者。NEDD9的表達(dá)水平可以作為一個(gè)獨(dú)立的肝癌預(yù)后指標(biāo),甚至包括一些臨床上難以判斷復(fù)發(fā)和預(yù)后的肝癌亞組。2、第二部分體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),肝癌細(xì)胞系中NEDD9 m RNA表達(dá)水平均明顯高于正常肝臟細(xì)胞系,肝癌細(xì)胞系的NEDD9蛋白表達(dá)水平顯著高于正常肝臟細(xì)胞系。肝癌細(xì)胞相比較正常肝臟細(xì)胞表現(xiàn)出了較強(qiáng)的增殖、遷移及侵襲能力,這種增殖、遷移以及侵襲能力的差異與其NEDD9 m RNA水平和蛋白水平的表達(dá)差異有著類似的趨勢(shì)。通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MHCC-97H以及Huh7細(xì)胞,分別上調(diào)和下調(diào)了兩種肝癌細(xì)胞中NEDD9的表達(dá)后發(fā)現(xiàn),經(jīng)過轉(zhuǎn)染上調(diào)NEDD9基因表達(dá)后的兩種肝癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)遷移以及侵襲能力都明顯增強(qiáng),而轉(zhuǎn)染下調(diào)NEDD9基因表達(dá)后的兩種肝癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)遷移和侵襲能力明顯減弱。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中裸鼠皮下移植瘤成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MHCC-97H肝癌細(xì)胞本身具有一定的成瘤能力,下調(diào)NEDD9表達(dá)后的MHCC-97H細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤成瘤能力則明顯弱于對(duì)照組MHCC-97H細(xì)胞,腫瘤體積明顯較小。裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表達(dá)正常水平NEDD9的MHCC-97H肝癌細(xì)胞有一定的幾率形成肝癌肺轉(zhuǎn)移,下調(diào)NEDD9表達(dá)水平后的MHCC-97H肝癌細(xì)胞基本不會(huì)造成裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移。3、第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明NEDD9可能通過調(diào)控Fascin蛋白的表達(dá)及其結(jié)構(gòu)的重組改變肝癌細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),從而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。上調(diào)肝癌細(xì)胞中NEDD9的表達(dá)后,轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug的表達(dá)水平亦會(huì)隨之上調(diào),而E-cadherin的表達(dá)水平會(huì)隨之下調(diào);下調(diào)NEDD9的表達(dá)后,轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug的表達(dá)水平亦會(huì)隨之下調(diào),而E-cadherin的表達(dá)水平會(huì)隨之上調(diào)。在肝癌細(xì)胞中上調(diào)NEDD9的表達(dá)后,金屬蛋白酶MMP-2以及MMP-9的表達(dá)水平亦會(huì)隨之上調(diào);下調(diào)NEDD9的表達(dá)后,金屬蛋白酶MMP-2以及MMP-9的表達(dá)水平亦會(huì)隨之下調(diào)。結(jié)論:NEDD9在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯升高,NEDD9的表達(dá)水平與腫瘤大小、腫瘤病理分化程度、有無其它臟器轉(zhuǎn)移、有無門靜脈侵犯以及腫瘤的TNM分期有關(guān)。NEDD9可以預(yù)測肝癌的復(fù)發(fā)及生存預(yù)后。NEDD9在體外及體內(nèi)影響了肝癌細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲等生物學(xué)特性。NEDD9可能通過調(diào)控Fascin蛋白的表達(dá)、重塑肝癌細(xì)胞骨架、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的EMT過程以及調(diào)控MMP-2、MMP-9的表達(dá)等方式影響了肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)特性。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 NEDD9 增殖 遷移 侵襲 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-31
• 第一部分 NEDD9在人肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義31-50
• 1 材料（包括所涉及的手術(shù)切除標(biāo)本、所用的試劑耗材以及設(shè)備儀器）31-33
• 1.1 試驗(yàn)中所涉及的組織標(biāo)本31
• 1.2 實(shí)驗(yàn)中所用的試劑及耗材31-32
• 1.3 實(shí)驗(yàn)中所用到的設(shè)備和儀器32-33
• 2 方法33-40
• 2.1 組織標(biāo)本的采集以及臨床病理資料的獲取33
• 2.2 RT-q PCR方法分析組織細(xì)胞中NEDD9 m RNA的表達(dá)水平33-35
• 2.3 Western blot檢測組織中NEDD9蛋白的表達(dá)35-38
• 2.4 免疫組織化學(xué)染色38-39
• 2.5 讀片39-40
• 2.6 隨訪和預(yù)后評(píng)估40
• 2.7 統(tǒng)計(jì)分析40
• 3 結(jié)果40-48
• 3.1 不同組織中NEDD9 m RNA表達(dá)水平的差異40-41
• 3.2 不同組織中NEDD9蛋白表達(dá)水平的差異41
• 3.3 NEDD9免疫組織化學(xué)染色41-43
• 3.4 NEDD9表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系43-44
• 3.5 NEDD9表達(dá)水平與肝癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)以及生存預(yù)后之間的關(guān)系44-45
• 3.6 單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析45-46
• 3.7 NEDD9在不同肝癌亞組中的預(yù)后價(jià)值46-48
• 4 討論48-50
• 第二部分 NEDD9對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲能力的影響50-77
• 1 材料（包括實(shí)驗(yàn)中所涉及的細(xì)胞系、所用的試劑耗材以及設(shè)備儀器）50-52
• 1.1 實(shí)驗(yàn)所涉及的細(xì)胞系50
• 1.2 試驗(yàn)中所用試劑以及耗材50-51
• 1.3 實(shí)驗(yàn)中所用到的設(shè)備和儀器51-52
• 2 方法52-64
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)52-53
• 2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染53-54
• 2.3 RT-q PCR檢測細(xì)胞中NEDD9 m RNA的表達(dá)54-57
• 2.4 Western blot檢測細(xì)胞中NEDD9蛋白的表達(dá)57-59
• 2.5 MTT法測定細(xì)胞活力59
• 2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)59-60
• 2.7 Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)60-61
• 2.8 Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)61-62
• 2.9 細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)62
• 2.10 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)62-63
• 2.11 裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移模型的建立63
• 2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析63-64
• 3 結(jié)果64-72
• 3.1 各種肝癌細(xì)胞系以及正常肝臟細(xì)胞系中NEDD9的差異性表達(dá)64-65
• 3.2 不同種類細(xì)胞系的遷移、侵襲能力的比較。65
• 3.3 不同種類細(xì)胞系的增殖能力的比較65-66
• 3.4 通過基因重組的方法上調(diào)和下調(diào)不同肝癌細(xì)胞系中NEDD9的表達(dá)66-67
• 3.5 NEDD9表達(dá)水平對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響67-68
• 3.6 NEDD9表達(dá)水平對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響68-69
• 3.7 NEDD9表達(dá)水平對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響69-71
• 3.8 NEDD9對(duì)MHCC-97H細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤成瘤能力的影響71
• 3.9 NEDD9在體內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。71-72
• 4 討論72-77
• 第三部分 NEDD9影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲的機(jī)制77-91
• 1 材料（包括實(shí)驗(yàn)中所涉及的細(xì)胞系、所用的試劑耗材以及設(shè)備儀器）77-78
• 1.1 實(shí)驗(yàn)所涉及的細(xì)胞系77
• 1.2 實(shí)驗(yàn)中所用試劑以及耗材77
• 1.3 設(shè)備儀器77-78
• 2 方法78-83
• 2.1 免疫熒光染色細(xì)胞骨架78
• 2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染78-80
• 2.3 Western blot檢測細(xì)胞中目的基因蛋白的表達(dá)80-83
• 3 結(jié)果83-86
• 3.1 NEDD9表達(dá)水平與細(xì)胞骨架重塑83
• 3.2 NEDD9表達(dá)水平對(duì)Fascin蛋白表達(dá)的影響83-84
• 3.3 NEDD9表達(dá)水平對(duì)Snail、Slug以及E-cadherin表達(dá)的影響84-85
• 3.4 NEDD9表達(dá)水平對(duì)MMP-2、MMP-9 表達(dá)的影響85-86
• 4 討論86-91
• 小結(jié)91-92
• 參考文獻(xiàn)92-107
• 個(gè)人簡歷和研究成果107-108
• 致謝108-109

  本文關(guān)鍵詞：NEDD9在肝癌中的表達(dá)及其與肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性之間關(guān)系的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：346802