本文關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌機(jī)制修復(fù)大鼠急性肺損傷的基礎(chǔ)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫綜合(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是臨床常見的呼吸系統(tǒng)危重疾病,發(fā)展快,病死率高,社會危害重。ALI和ARDS常由創(chuàng)傷、感染、膿毒癥、休克、體外循環(huán)和廣泛的燒傷等因素引起。ALI患者如果不及時治療常發(fā)展為ARDS。 ARDS患者常表現(xiàn)為呼吸困難和難以糾治的低氧血癥,患者死亡率高。目前為止,ALI和ARDS的臨床治療策略主要有呼吸支持、感染預(yù)防、嚴(yán)格控制液體輸入,此外肺保護(hù)性藥物的應(yīng)用也有助于患者的恢復(fù),例如吸入肺泡表面活性物質(zhì)、N0、糖皮質(zhì)激素、抗氧化劑等手段,但療效依然十分有限。ALI和ARDS患者的預(yù)后也因原發(fā)病的不同而有所差異,全身感染引發(fā)的ALI患者如果發(fā)展成為ARDS預(yù)后往往很差；骨髓移植患者機(jī)體抵抗力降低,如果并發(fā)ARDS死亡率往往100%。目前ALI和ARDS的發(fā)病率和死亡率依然很高,危害重,對新治療策略的需求依然十分迫切。細(xì)胞治療被認(rèn)為是一種潛在、有前景的治療方法。目前間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)用于肺部疾病的基礎(chǔ)研究和治療多有報(bào)道,國內(nèi)外研究學(xué)者從不同角度探討MSC用于ALI和ARDS治療的作用機(jī)制。盡管有關(guān)干細(xì)胞用于ALI治療的基礎(chǔ)研究報(bào)道較多,但機(jī)制仍未完全闡明。MSC最早發(fā)現(xiàn)于骨髓,在胎盤、臍帶和羊水中也相繼發(fā)現(xiàn)。根據(jù)既往研究結(jié)果認(rèn)為MSC具有自我復(fù)制、免疫調(diào)節(jié)、多向分化潛能,例如分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。MSC在體外培養(yǎng)過程呈貼壁生長,類成纖維樣.間充質(zhì)干細(xì)胞陽性表達(dá)CD73、CD29、CD90和CD105等細(xì)胞表面標(biāo)記物,陰性表達(dá)CD34、 CD11b、C14和CD45等。越來越多的研究報(bào)道MSC在創(chuàng)傷、心臟、皮膚、整形、燒傷等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛,通過其損失修復(fù)、再生等機(jī)制為臨床提供更多的治療選擇。截至目前有關(guān)干細(xì)胞的應(yīng)用不斷報(bào)道,例如骨髓來源的干細(xì)胞通過靜脈注射、氣管注入等途徑可遷入炎癥部位,在微環(huán)境中表達(dá)原位細(xì)胞的特異蛋白；另據(jù)報(bào)道在給予MSCs后,MSCs可以移入機(jī)體的炎癥反應(yīng)部位,緩解炎癥反應(yīng),減輕炎癥損傷。近來報(bào)道MSC分泌的因子具有修復(fù)受損的細(xì)胞、組織等功能而受到重視。近來間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于骨組織、軟骨組織、關(guān)節(jié)和心肌細(xì)胞損傷后的修復(fù)等基礎(chǔ)研究報(bào)道較多。據(jù)報(bào)道MSCs經(jīng)靜脈注入小鼠體內(nèi)后可以移入肺內(nèi)并表達(dá)肺泡上皮細(xì)胞的特性和標(biāo)記物；研究報(bào)道MSC具有免疫調(diào)節(jié)功能,MSCs可以減少促炎因子的釋放,增加抗炎因子的產(chǎn)生從而達(dá)到減輕肺損傷的作用；MSC可以分泌可溶性因子如KGF、EGF和LL-37等,部分因子具有修復(fù)受損肺泡毛細(xì)血管膜,減低肺泡毛細(xì)血管通透性,從而達(dá)到修復(fù)急性肺損傷的作用；目前研究表明MSC移入受損部位的比率較低,以此解釋MSC修復(fù)ALI的可能性較��；MSC通過免疫調(diào)節(jié)作用在一定程度緩解了ALI的損傷,但仍不能完全解釋其修復(fù)ALI的作用機(jī)制。在肺泡上皮細(xì)胞發(fā)揮重要的作用,如肺二型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell type Ⅱ, AT-Ⅱ)分泌肺泡表面活性物質(zhì)降低肺泡表面張力；通過轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子清除肺泡內(nèi)殘留液體以保持肺泡內(nèi)干燥。MSC可能通過修復(fù)炎癥損傷的肺二型上皮細(xì)胞發(fā)揮其修復(fù)作用。肺泡上皮細(xì)胞在肺泡液清除過程發(fā)揮重要作用,肺泡上皮細(xì)胞清除肺泡內(nèi)電解質(zhì)和水分子的作用被定義為(Alveolar fluid clearance, AFC), MSC分泌的生長因子可能具有促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)離子和水分子功能,從而保持肺泡的干燥。AFC對于判斷病人的預(yù)后有重要的參考價值,ALI過程合并AFC的受損,AFC與患者的死亡率密切相關(guān)。AT-Ⅱ與肺一型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell type Ⅰ, AT-Ⅰ)均有轉(zhuǎn)運(yùn)肺泡內(nèi)液體的功能,尤其AT-Ⅱ發(fā)揮重要作用。正常的肺水清除過程AT-Ⅱ頂端的鈉離子通道、水通道以及細(xì)胞底部的鈉鉀ATP酶(sodium-potassium adenosine triphosphatase, Na-K-ATPase)均參與肺水的清除,在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中鈉通道和Na-K-ATPase發(fā)揮重要作用。在炎癥過程肺泡毛細(xì)血管膜在促炎癥介質(zhì)白介素(IL-1 β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和干擾素(IFN-γ)等作用后造成肺泡毛細(xì)血管膜損傷,肺泡內(nèi)出現(xiàn)滲出性改變,肺泡毛細(xì)血管膜增厚,二氧化碳及氧氣的彌散距離增加；AT-Ⅱ分泌肺泡表面活性物質(zhì)減少,肺順應(yīng)性下降,通氣障礙。AT-Ⅱ細(xì)胞和AT-Ⅰ細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降。所以本課題基于MSCs緩解炎癥反應(yīng),降低急性肺損傷,但MSCs修復(fù)受損的AFC報(bào)道較少,機(jī)制不明。AT-Ⅱ細(xì)胞受損后AFC能力降低,AFC對判斷患者的預(yù)后有重要參考價值,所以探明MSCs旁分泌機(jī)制修復(fù)肺上皮細(xì)胞的AFC能力具有重要的意義。研究方法1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：麻醉并處死SD大鼠,分離大鼠股骨及脛骨骨髓腔內(nèi)細(xì)胞至培養(yǎng)皿,細(xì)胞貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-MSC, BM-MSC).24小時后更換培養(yǎng)基,此后每三天剛換一次培養(yǎng)基,放置細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)(5%C02,37℃)。細(xì)胞生長至80%酶消化法傳代,3-6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測技術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記物,使用成脂及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)BM-MSCs,鑒定MSC多項(xiàng)分化潛能。單克隆實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞自我復(fù)制能力,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測BM-MSC表面標(biāo)記物。2.肺二型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：麻醉并處死SD大鼠,消毒、抗凝后放置超凈臺。打開胸腔,沖洗肺循環(huán)至肺組織發(fā)白。剪出肺組織使用PBS液沖洗肺遠(yuǎn)端氣道。利用胰蛋白酶消化、差速離心、細(xì)胞貼壁的方法分離大鼠AT-Ⅱ細(xì)胞。DMEM/F12培養(yǎng)細(xì)胞,利用免疫熒光技術(shù),肺泡表面活性物質(zhì)(surfactant protein A, SP-A)鑒定大鼠AT-Ⅱ細(xì)胞。3.共培養(yǎng)模型的建立：本實(shí)驗(yàn)探索MSCs旁分泌機(jī)制修復(fù)受損后的AT-Ⅱ細(xì)胞,建立共培養(yǎng)體系。4. AT-Ⅱ細(xì)胞細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：利用CCK-8試劑檢測AT-Ⅱ在炎癥刺激后增殖情況以及共培養(yǎng)后MSCs對AT-Ⅱ細(xì)胞的影響作用。首先AT-Ⅱ(1×10‘)于上室培養(yǎng),建立炎癥環(huán)境,構(gòu)建炎癥環(huán)境的三個主要促炎癥因子TNF-α、IL6和IL1-β,因子濃度分別為1.7ng/ml,87.6ng/ml和4.4ng/ml用以損傷AT-Ⅱ;正常培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)AT-Ⅱ細(xì)胞作為陰性對照；MSCs與炎癥刺激后的AT-Ⅱ共培養(yǎng)。連續(xù)觀察72h測定細(xì)胞增殖,應(yīng)用酶標(biāo)儀(450nm)測定光密度。5.KGF分泌以及KGF-SiRNA干擾效率分析：MSC促進(jìn)炎癥刺激后AT-Ⅱ的增殖活性。我們建立了如下四種共培養(yǎng)體系,各組的實(shí)驗(yàn)條件如下：①M(fèi)SCs, ②MSCs+cytomix, ③MSCs+AT-Ⅱ細(xì)胞,④AT-Ⅱ cells+ cytomix。下小室培養(yǎng)MSCs,或在上小室內(nèi)培養(yǎng)AT-Ⅱ。共培養(yǎng)48小時取培養(yǎng)基上清,利用ELISA方法測定KGF的分泌。利用lipofectamine 2000為載體轉(zhuǎn)染KGF-SiRNA,在轉(zhuǎn)染48小時后測定KGF分泌水平,了解SiRNA的干擾效率。Cytomix包括TNF-α、IL6和IL1-β等炎癥因子。6. MSCs靜脈注入大鼠肺內(nèi)示蹤：利用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) (10mg/kg)經(jīng)鼠尾靜脈注射構(gòu)建大鼠ALI模型,4h后經(jīng)鼠尾靜脈注射DiI標(biāo)記的MSCs (5×105)。MSCs注射后15min,2h,24hand 72h分別麻醉并處死大鼠,獲取肺組織,利用小動物成像技術(shù)分析MSCs注射大鼠體內(nèi)后肺內(nèi)留存。同時制作15min,24h and 72h時間點(diǎn)的肺組織冰凍切片,了解MSCs在注射大鼠肺組織后肺內(nèi)分布。7.病理評價及肺濕/干比：7-8周的大鼠隨機(jī)分配成6組,第一組大鼠注射PBS液;第二組注入LPS,4h后注射PBS;第三組注射LPS,4h后注射MSCs;第四組注射LPS,4h后注射KGF-SiRNA;第五組注射LPS,4h后注射lipofectamine 2000;第六組注射72h后麻醉并處死大鼠并獲取肺組織,右側(cè)肺葉制作石蠟切片并HE染色,左肺葉測濕/干重。8.α1和β1亞基的蛋白及基因分析：建立體外共培養(yǎng)體系,體外實(shí)驗(yàn)條件如下：AT-Ⅱ細(xì)胞+PBS(對照組),炎癥攻擊AT-Ⅱcells + PBS,3) AT-II細(xì)胞+MSCs,4)炎癥攻擊AT-Ⅱ細(xì)胞+MSCs,5)炎癥攻擊AT-Ⅱ細(xì)胞+MSCs(KGF-siRNA),6)炎癥攻擊AT-Ⅱ細(xì)胞+MSCs-lipof。模擬炎癥環(huán)境TNF-α、IL6 and IL1-β (1.7ng/ml,87.6ng/ml and 4.4ng/ml)。共培養(yǎng)72h后分別應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western blot)及實(shí)時定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(quantitative polumerase chain reaction, qPCR)分析Na-K-ATPase α1和β1亞基的改變。9. PI3K/Akt/mTOR信號通路分析：為進(jìn)一步分析MSCs修復(fù)AT-Ⅱ的可能機(jī)制。通過Western blot分析MSCs與AT-Ⅱ cells共培養(yǎng)后AT-Ⅱ的蛋白p-AKT、 AKT、p-mTOR和mTOR改變。10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,所有數(shù)據(jù)表達(dá)為X±SD,采用SPSS13.0分析軟件。單組計(jì)量資料采用采用one-sample t test; 3組以上獨(dú)立樣本采用單因素方差分析(One-way ANOVA),進(jìn)一步多重比較采用LSD；重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.大鼠BM-MSC在培養(yǎng)皿呈貼壁、成纖維樣生長。3-8代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CD29, CD44, CD90和CD105,陰性表達(dá)CD34 and CD45。BM-MSC從單個細(xì)胞到克隆形成,提示其自我復(fù)制能力。脂肪誘導(dǎo)及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后鑒定呈陽性。肺二型上皮細(xì)胞經(jīng)分離培養(yǎng)后呈現(xiàn)圓形、鋪路石樣貼壁生長。經(jīng)肺泡表面活性物質(zhì)A(surfactant protein A, SP-A)抗體標(biāo)記,免疫熒光檢測呈陽性表達(dá)。2.CCK-8方法測定AT-Ⅱ細(xì)胞在炎癥損傷后,細(xì)胞增殖呈現(xiàn)下調(diào)趨勢；AT-Ⅱ與MSCs經(jīng)共培養(yǎng)后細(xì)胞增殖呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。提示MSCs通過旁分泌作用促進(jìn)AT-Ⅱ細(xì)胞的增殖。3.MSC在無血清DMEM/F12條件下培養(yǎng)48小時檢測KGF濃度為437.65 pg/ml,炎癥刺激后KGF濃度為884.17 pg/ml;當(dāng)MSCs與AT-Ⅱ細(xì)胞共培養(yǎng)條件下KGF濃度為382.37 pg/ml; AT-Ⅱ分泌KGF濃度明顯較少。說明在二者的共培養(yǎng)體系內(nèi)MSCs是KGF的主要來源。使用cy5標(biāo)記的SiRNA轉(zhuǎn)染MSCs,結(jié)果提示大多數(shù)MSCs被成功轉(zhuǎn)染SiRNA。MSCs被轉(zhuǎn)染KGF-SiRNA后,KGF的分泌明顯降低。4.DiI標(biāo)記MSCs經(jīng)鼠尾靜脈注入大鼠體內(nèi)。小動物成像技術(shù)觀察注射后15min肺內(nèi)有大量的MSCs存留,但在2h和24h時間點(diǎn)MSCs在肺內(nèi)逐步減少,72h肺內(nèi)依然有MSCs留存,但細(xì)胞光強(qiáng)值明顯下降。冰凍切片提示注射后15min肺內(nèi)MSCs呈聚集現(xiàn)象,在24h與72h時間點(diǎn)細(xì)胞在肺內(nèi)散在分布,在肺泡內(nèi)可見DiI標(biāo)記的MSCs5.大鼠鼠尾靜脈注射LPS病理結(jié)果提示肺泡內(nèi)炎性滲出和肺泡間隔增厚。注射MSCs后肺泡炎性滲出液減少和肺泡間隔變小。KGF-SiRNA轉(zhuǎn)染MSC后,MSC的治療作用減弱。肺組織濕/干比在大鼠注入LPS后升高。繼LPS鼠尾靜脈注入MSCs濕/干下降,LPS后大鼠注入KGF-SiRNA轉(zhuǎn)染的MSCs,濕/干比上升。6.α1和β1亞基在炎癥因子損傷下,在蛋白和基因水平二者的表達(dá)均下降。與MSCs共培養(yǎng)48小時,α1和β1表達(dá)上調(diào)。炎癥刺激下的AT-Ⅱ細(xì)胞與KGF-SiRNA干擾后的MSCs培養(yǎng)后,α1亞基表達(dá)明顯下調(diào),然而β1亞基無明顯的改變。提示MSC可能通過KGF的分泌促進(jìn)α1亞基的表達(dá)而非β1亞基。同時MSC促進(jìn)了AT-Ⅱ細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號通路p-AKT和p-mTOR蛋白的改變。結(jié)論1. MSCs在炎性條件比非炎性條件分泌更多的KGF。DiI標(biāo)記的MSCs注入大鼠體內(nèi),早期肺內(nèi)留存較多,后逐步下降,在注射后72后MSCs在肺內(nèi)依然有存留。2.大鼠注入LPS后肺內(nèi)炎性滲出增加,濕/干比升高,注入MSCs后肺泡內(nèi)液體消失,濕/干比重下調(diào),MSC可能通過促進(jìn)AFC的作用減輕大鼠的記性肺損傷。3.體外共培養(yǎng)結(jié)果提示MSCs分泌的KGF促進(jìn)了AT-Ⅱ細(xì)胞Na-K-ATPaseα1表達(dá),而β 1亞基無明顯的改變。4.MSC可能通過激活KGF-dependent的PI3K/Akt/mTOR信號通路從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和α1亞基的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：急性肺損傷 肺水清除率 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 肺二型上皮細(xì)胞 鈉鉀 ATP酶
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563.8
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 前言22-37
• 參考文獻(xiàn)29-37
• 第一章 大鼠肺泡二型上皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定37-55
• 第一節(jié) 肺泡二型上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定37-44
• 1. 材料與方法37-41
• 2 結(jié)果41-42
• 3 討論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-44
• 第二節(jié) 大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定44-55
• 1 材料與方法44-51
• 2 結(jié)果51-53
• 3 討論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-55
• 第二章 AT-Ⅱ細(xì)胞與MSC共培體系的建立及KGF的分泌55-67
• 1 材料和方法55-59
• 1.1 材料55-56
• 1.2 方法56-59
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理59
• 2結(jié)果59-64
• 2.1 三個不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞AT-Ⅱ細(xì)胞經(jīng)過共培養(yǎng)后細(xì)胞增殖分析59-61
• 2.2 KGF的分泌61-62
• 2.3 KGF SiRNA干擾MSCs效率檢測62-64
• 3 討論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-67
• 第三章 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞肺內(nèi)示蹤67-75
• 1 材料與方法68-70
• 1.1 材料68-69
• 1.2 方法69
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理69-70
• 2 結(jié)果70-72
• 3 討論72-73
• 參考文獻(xiàn)73-75
• 第四章 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)急性肺損傷大鼠的體內(nèi)研究75-84
• 1 材料與方法76-78
• 1.1 材料及儀器設(shè)備76
• 1.2 方法76-77
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理77-78
• 2 結(jié)果78-80
• 2.1 病理改變78
• 2.2 肺濕/干比78-80
• 3 討論80-82
• 參考文獻(xiàn)82-84
• 第五章 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)損傷肺泡二型上皮細(xì)胞84-99
• 1 材料與方法84-91
• 1.1 材料84-86
• 1.2 方法86-91
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理91
• 2 結(jié)果91-96
• 2.1 α1和β1亞基的細(xì)胞免疫熒光檢測91-92
• 2.2 α1和β1亞基在蛋白水平的改變92-94
• 2.3 α 1和β1亞基在基因水平的改變94-96
• 3 討論96-97
• 參考文獻(xiàn)97-99
• 第六章 肺二型上皮細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號通路的檢測99-107
• 1 材料與方法99-102
• 1.1 材料99-101
• 1.2 方法101-102
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理102
• 2 結(jié)果102-103
• 2.1 p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR在蛋白水平的變化趨勢102-103
• 3 討論103-105
• 參考文獻(xiàn)105-107
• 全文總結(jié)107-109
• 英文縮寫注釋109-110
• 攻讀博士學(xué)位期間主要成果110-111
• 致謝111-114
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明114

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本文編號：346810