本文關鍵詞：Inpp5f在糖尿病心肌病變中的作用及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：糖尿病嚴重威脅人類健康。近些年,糖尿病的患病率大幅度上升,并且在未來的25年里將成為世界上引起致殘和致死的主要的因素之一。糖尿病心肌病表現(xiàn)為心室功能障礙,與冠狀動脈和高血壓無關,是糖尿病患者發(fā)病率和死亡率的首要原因,但是糖尿病心肌病的具體發(fā)病機制還不清楚。胰島素缺乏的1型糖尿病和胰島素抵抗的2型糖尿病與代謝性應激(主要是高血壓和高血脂)一起是公認的糖尿病心肌病發(fā)病的危險因素。這些危險因素共同作用可降低葡萄糖攝取,促進脂肪酸的攝取和氧化。這種代謝方式的轉(zhuǎn)變在心肌病的形成中發(fā)揮著重要的作用,但具體的分子機制并不十分清楚。胰島素/PI3K/Akt信號通路在整個分子事件中發(fā)揮重要的作用。因此,研究胰島素/PI3K/Akt信號通路在糖尿病中是如何調(diào)整信號轉(zhuǎn)錄方式以及如何發(fā)生異常顯得至關重要。Inpp5f(Inositol polyphosphate-5-phosphatase F)編碼全長為1132aa的蛋白,該蛋白含有一個352aa的SAC磷酸酶結(jié)構域。Inpp5f是一種肌醇磷酸酶,主要在心、腦、腎表達。近期研究發(fā)現(xiàn)Inpp5f是Akt信號的負調(diào)控因子,但是該分子在糖尿病心臟中的表達和功能還不清楚。因此,本課題旨在探討Inpp5f在糖尿病心肌病中的作用以及具體的分子機制�！灸康摹�1)在糖尿病動物模型中查看Inpp5f的表達變化,分析糖尿病相關因素(胰島素、高糖和高脂)與Inpp5f表達的相關性;2)心臟病理和超聲心動圖評價動物心臟功能,分析Inpp5f表達與糖尿病小鼠心肌病變的相關性;3)分析糖尿病心肌病變中Inpp5f表達變化的原因:代謝應激(胰島素、高糖和高脂)對Inpp5f表達的影響;4)探討胰島素、高糖和高脂等代謝應激影響Inpp5f表達的深層次分子機制;5)探討Inpp5f的表達異常是否影響心肌細胞的胰島素信號和生理功能。【方法和結(jié)果】1)通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立1型糖尿病模型,通過高脂飲食(HFD)誘導的方法建立2型糖尿病模型;q RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示糖尿病小鼠心臟組織中Inpp5f的表達升高;統(tǒng)計學結(jié)果表明胰島素,血糖,膽固醇和甘油三酯的水平與Inpp5f的表達具有相關性。2)超聲和組織學結(jié)果顯示糖尿病小鼠的心臟發(fā)生結(jié)構和功能改變,包括心臟增大,射血分數(shù)值(EF)降低,左室等容舒張時間(IVRT)延長;統(tǒng)計學分析結(jié)果表明Inpp5f的表達與EF值呈負相關,與IVRT呈正相關。3)在H9C2心肌細胞中,使用胰島素、高糖或游離脂肪酸刺激,q RT-PCR和Westernblot檢測Inpp5f的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島素,高糖和脂肪酸均能增加H9C2中Inpp5f的表達。4)Westernblot結(jié)果顯示胰島素使心肌細胞Sp1的表達升高;而高糖和游離脂肪酸處理使心肌細胞NF-κB信號活化;q RT-PCR和Westernblot結(jié)果表明Sp1抑制劑能降低胰島素對Inpp5f的表達促進作用,而NF-κB的抑制劑能降低高糖和游離脂肪酸引起的Inpp5f表達升高。5)雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示胰島素,高糖和游離脂肪酸使Inpp5f的啟動子活性升高,而Sp1和NF-κB的抑制劑降低了代謝應激引起的Inpp5f啟動子活性升高;免疫共沉淀(Ch IP)結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子Sp1和NF-κB能夠和Inpp5f的啟動子結(jié)合;6)Westernblot結(jié)果顯示腺病毒介導的Inpp5f的過表達能降低心肌細胞Akt磷酸化水平,而干涉Inpp5f的表達則導致Akt磷酸化水平升高;高糖和游離脂肪酸能降低心肌細胞內(nèi)Akt的磷酸化水平,但干涉Inpp5f的表達能逆轉(zhuǎn)上述變化;利用流式細胞術探討細胞葡萄糖攝取的實驗中發(fā)現(xiàn),干涉Inpp5f能促進心肌細胞對葡萄糖的攝取�！窘Y(jié)論】我們發(fā)現(xiàn)一個新的磷酸酶Inpp5f在糖尿病心肌病變中扮演了重要角色。Inpp5f在糖尿病心肌病變的失代償期表達升高,其表達量與心臟功能有顯著的相關性;在分析Inpp5f表達升高原因時發(fā)現(xiàn),胰島素、高糖和高脂因素均能導致其表達增加,進一步研究發(fā)現(xiàn),胰島素通過活化Sp1轉(zhuǎn)錄因子,而高糖和高脂則通過活化NF-κB信號轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)Inpp5f的表達;Inpp5f能抑制心肌細胞Akt的磷酸化以及心肌細胞對葡萄糖的攝取。綜合這些結(jié)果,我們提出了一個糖尿病心臟損傷過程中的分子調(diào)節(jié)環(huán)路,即正常情況下,胰島素通過活化PI3K/Akt促進心肌細胞葡萄糖的攝取,與此同時通過轉(zhuǎn)錄機制誘導負性調(diào)控分子Inpp5f的表達,控制PI3K/Akt的活性,獲得信號調(diào)節(jié)的平衡。糖尿病病變早期,胰島素減少或抵抗導致PI3K/Akt的活性降低,此時,負性調(diào)節(jié)因子Inpp5f的表達同樣降低,心肌細胞處于代償期。隨著糖尿病不斷進展,高糖/高脂因素積累后誘發(fā)持續(xù)的微炎癥狀態(tài),NF-κB信號活化。NF-κB信號通過轉(zhuǎn)錄機制促進Inpp5f的表達,表達升高的Inpp5f進一步抑制PI3K/Akt,因而加重心臟損傷。我們提出了一個新的胰島素、高糖、高脂因素影響Inpp5f/PI3K/Akt信號的調(diào)節(jié)環(huán)路,闡明了該環(huán)路調(diào)節(jié)在糖尿病心肌病變中的作用,為糖尿病心肌病變的診治提供了新的思路。
【關鍵詞】：糖尿病 心肌病 Inpp5f PI3K/Akt 反饋環(huán)路
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-17
• 前言17-18
• 文獻回顧18-36
• 第一部分：糖尿病小鼠模型的建立及Inpp5f在心臟組織中的表達36-48
• 1． 材料36-37
• 1.1 實驗材料36
• 1.2 主要試劑36-37
• 1.3 主要儀器37
• 2．方法37-42
• 2.1 STZ和HFD糖尿病小鼠模型的建立37
• 2.2 Inpp5f在糖尿病小鼠心臟組織中的表達37-41
• 2.3 糖尿病小鼠模型血清學檢測41-42
• 3.結(jié)果42-46
• 3.1 糖尿病小鼠模型的血清學指標檢測：42-44
• 3.2 糖尿病小鼠心臟組織中Inpp5f的表達44-45
• 3.3 糖尿病小鼠血清學指標與心臟Inpp5f表達的相關性分析45-46
• 4.討論46-48
• 第二部分：Inpp5f表達與糖尿病小鼠心臟功能的相關性分析48-55
• 1．材料48-49
• 1.1 實驗材料48
• 1.2 主要試劑48
• 1.3 主要儀器48-49
• 2. 方法49-50
• 2.1 糖尿病小鼠心臟形態(tài)和功能檢測49-50
• 3. 結(jié)果50-53
• 3.1 糖尿病小鼠模型心臟形態(tài)觀察及心臟功能檢測50-51
• 3.2 心臟Inpp5f表達水平及其與心臟功能的相關性51-53
• 4.討論53-55
• 第三部分：Inpp5f在糖尿病小鼠心臟中表達升高原因分析55-59
• 1．材料55-56
• 1.1 實驗材料55
• 1.2 主要試劑55-56
• 1.3 主要儀器56
• 2.方法56-57
• 2.1 細胞培養(yǎng)和藥物處理56-57
• 3.結(jié)果57-58
• 4.討論58-59
• 第四部分：Inpp5f表達的深層分子機制探討59-70
• 1．材料59-60
• 1.1 實驗材料59
• 1.2 主要試劑59-60
• 1.3 主要儀器60
• 2.方法60-64
• 2.1 載體構建60-61
• 2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染61
• 2.3 Inpp5f啟動子雙熒光素酶報告系統(tǒng)61
• 2.4 胞漿蛋白和核蛋白提取61-62
• 2.5 染色質(zhì)免疫共沉淀（Ch IP）62-64
• 3.結(jié)果64-68
• 3.1 Inpp5f種屬保守性分析和啟動子序列分析64-65
• 3.2 胰島素，高糖和FFA通過不同轉(zhuǎn)錄因子促進Inpp5f的表達65-67
• 3.3 Sp1和NF-κB直接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)Inpp5f表達67-68
• 4.討論68-70
• 第五部分：Inpp5f對心肌細胞Akt活性和葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響70-76
• 1．材料70-71
• 1.1 實驗材料70
• 1.2 主要試劑70-71
• 1.3 主要儀器71
• 2.方法71-73
• 2.1 si RNA轉(zhuǎn)染71-72
• 2.2 流式細胞術檢測 2-NBDG的攝取72
• 2.3 腺病毒載體的構建和病毒包裝72
• 2.4 Akt活性檢測72-73
• 3．結(jié)果73-75
• 3.1 糖尿病心臟組織中Inpp5f表達與Akt活性的相關性分析73
• 3.2 心肌細胞中Inpp5f對Akt的影響73-74
• 3.3 Inpp5f對心肌細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響74-75
• 4.討論75-76
• 小結(jié)76-78
• 參考文獻78-89
• 個人簡介和研究成果89-91
• 致謝91-92

  本文關鍵詞：Inpp5f在糖尿病心肌病變中的作用及其機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：345809