發(fā)布時間：2017-05-02 15:01

  本文關鍵詞：丹酚酸B通過PPAR-γ和LXRα途徑促進巨噬細胞ABCA1依賴的膽固醇流出，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與研究目的隨著社會物質(zhì)的極大豐富及飲食結(jié)構(gòu)的巨大改變,世界人口中血脂異常人群的比例明顯高于以前。血脂異常作為代謝綜合癥的組分之一,與多種疾病如肥胖癥、2型糖尿病、高血壓、冠心病、腦卒中等密切相關。長期血脂異常可導致動脈粥樣硬化、增加心腦血管病的發(fā)病率和死亡率。動脈粥樣硬化性疾病已成為全世界人群死亡的主要原因,占總死亡率的50%。動脈粥樣硬化的形成是一個需要經(jīng)歷許多年過程。內(nèi)皮激活／損傷,LDL攝取、滯留和氧化,單核細胞浸潤轉(zhuǎn)變成巨噬細胞并最終變成富含脂質(zhì)的泡沫細胞,動脈中層平滑肌細胞增殖遷移至內(nèi)膜,以及血栓形成構(gòu)成動脈粥樣硬化病變。過多的膽固醇被巨噬細胞吞噬后變成了泡沫細胞,此過程是動脈粥樣硬化的早期重要特征,也是動脈粥樣硬化病變的起始機制和重要病理基礎。膽固醇從巨噬細胞流出可以防止動脈粥樣硬化的進展。HDL-C與其他脂蛋白相比,最主要特點是顆粒最小,密度最高,蛋白質(zhì)和脂肪含量約各占一半,載脂蛋白以ApoA Ⅰ和ApoA Ⅱ為主。HDL的生理功能是將外周組織包括動脈壁在內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運到肝臟進行代謝,這一過程稱為膽固醇的逆轉(zhuǎn)運,是HDL抗動脈粥樣硬化作用的主要機制。膽固醇的逆轉(zhuǎn)運是機體排除過多膽固醇的唯一途徑,對維持生物體膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)具有重要意義,也是目前認為機體對抗動脈粥樣硬化發(fā)生的主要機制之一。膽固醇逆轉(zhuǎn)運的影響因素及調(diào)控機制多而復雜。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1(ABCA1)是一種整合膜蛋白,它以ATP為能源,促進細胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂流出至細胞外貧脂的ApoA I。ABCA1基因突變的Tangier病患者和ABCA1基因敲除的小鼠均表現(xiàn)出細胞內(nèi)膽固醇外流障礙。ABCA1首先介導泡沫細胞內(nèi)的磷脂流出,磷脂流出后與細胞外ApoAⅠ結(jié)合,形成盤狀復合物；在其誘導下,使細胞內(nèi)的游離膽固醇流出并與該復合物相結(jié)合,從而形成前β-HDL,接著在卵磷脂膽固醇酯酰轉(zhuǎn)移酶作用下,前β-HDL轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腍DL。因此,ABCA1是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)膽固醇外流關鍵的限速蛋白,ABCA1在膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮了非常關鍵的作用。ABCA1在體內(nèi)的表達受多個因素所調(diào)節(jié),研究較多的是核受體家族,如過氧化物酶體增殖激活型受體(PPARs)、肝孤兒受體(LXR)、視黃醇X受體(RXR)等,它們均可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控ABCA1的表達。PPARs包括PPAR-α, PPAR-β和PPAR-γ三種亞型。其中PPAR-γ是核受體家族最重要的成員之一,現(xiàn)在認為PPAR-γ參與調(diào)節(jié)巨噬細胞脂質(zhì)代謝和細胞分化。PPAR-γ作為一個關鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,可調(diào)控多個介導膽固醇轉(zhuǎn)運的基因表達。LXR是核受體超家族成員,有LXRα和LXRβ兩種亞型。LXRα可調(diào)節(jié)肝臟、巨噬細胞和小腸內(nèi)膽固醇代謝相關的許多靶基因。研究證實,LXR激動劑可上調(diào)巨噬細胞ABCA1的表達,導致細胞內(nèi)膽固醇的流出。丹酚酸B (Salvianolic acid B, Sal B)是提取的丹參干燥根及根莖中的有效成分。Sal B為一分子咖啡酸和三分子丹參素縮合而成,是丹參活性最強的水溶性提取物之一,也是研究較多的丹參酚酸。以往的研究已證實,Sal B能改善血流動力學,降低氧化損傷和修復血管內(nèi)皮功能。在過去的幾年中Sal B以及其他的丹參提取物質(zhì)在中國甚至有些西方國家已廣泛用于動脈粥樣硬化性血管疾病包括冠心病和中風。Sal B能夠清除羥自由基,超氧陰離子自由基,抑制脂質(zhì)過氧化,因而被視為一種抗氧化劑。Sal B被證實是一種有效的CD36拮抗劑,抑制巨噬細胞依賴于CD36對修飾型低密度脂蛋白的攝取。Sal B能抑制血小板的聚集和活化,通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9穩(wěn)定粥樣斑塊改善預后。在飲食誘導的高膽固醇血癥兔模型中,Sal B能抑制LDL的氧化修飾,降低血漿膽固醇水平,改善內(nèi)皮損傷和動脈粥樣硬化的嚴重程度。上述研究結(jié)果表明,膽固醇逆轉(zhuǎn)運被證實是脂質(zhì)代謝HDL防止動脈粥樣硬化的主要機制。Sal B在脂質(zhì)代謝和抗動脈粥樣硬化過程中扮演了重要角色。然而,目前關于Sal B對膽固醇流出影響的研究較少,本研究以PMA誘導THP-1源性巨噬細胞為研究對象,檢測Sal B對膽固醇流出的影響。在蛋白和-nRNA水平測定THP-1源性巨噬細胞ABCA1表達,及PPAR-γ和LXRa蛋白水平的表達。采用PPAR-γ和LXRa激動劑及拮抗劑檢測Sal B誘導的促進脂質(zhì)外排過程中的作用,從而澄清Sal B與膽固醇流出的關系及其可能的作用機制。研究方法1.THP-1源性巨噬細胞的培養(yǎng)：人THP-1單核細胞在160nmol/ml PMA作用72h,誘導THP-1細胞分化生成巨噬細胞。2.THP-1源性巨噬細胞在50mg/L ox-LDL和1.0μCi/ml [3H]-膽固醇作用24h,誘導生成負載膽固醇的巨噬細胞。3. Sal B (0,0.1,1 and 10μM)作用于荷脂的THP-1源性巨噬細胞24h,及10μM Sal B作用于細胞0、3、6、12、24 h。液體閃爍法測定放射性物質(zhì)進出細胞,評價Sal B對膽固醇流出的影響。4. Sal B作用于THP-1源性巨噬細胞,Real-time PCR方法檢測ABCA1 mRNA水平的表達；Western blot方法檢測ABCA1蛋白水平的變化。5.Sal B作用于THP-1源性巨噬細胞,Western blot方法檢測PPAR-γ和LXRα蛋白水平的表達。6. PPAR-γ和LXRα激動劑及拮抗劑分別與Sal B共同作用于THP-1源性泡沫細胞24h, Real-time PCR方法檢測ABCA1 mRNA水平的表達；Western blot方法檢測ABCA1蛋白水平的變化。7. PPAR-γ和LXRa激動劑及拮抗劑分別與Sal B共同作用于荷脂THP-1源性巨噬細胞24h,測定膽固醇流出率。研究結(jié)果1. Sal B對負載膽固醇THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出率的影響：在ApoA-I, HDL2或HDL3存在情況下,用不同濃度的Sal B (0,0.1,1 and 10μM)處理荷脂的THP-1源性巨噬細胞24h。與對照組比,1μM Sal B能促進膽固醇流出至ApoA Ⅰ和HDL2 (P0.05),10μM Sal B促進膽固醇流出至ApoAⅠ和HDL2約是對照組2.5倍和3.2倍(P0.01)。同時,10μM Sal B也能促進膽固醇流出至HDL3 (P0.05)。10μM Sal B處理負載膽固醇的THP-1源性巨噬細胞0、3、6、12、24 h。結(jié)果顯示,6h之內(nèi)Sal B不能發(fā)揮對膽固醇流出至三種介質(zhì)的作用；12h后Sal B明顯增強膽固醇流出(P0.05),培養(yǎng)24h后可顯著增強膽固醇流出至ApoA Ⅰ和HDL2(P0.01)。以上結(jié)果表明Sal B以濃度和時間依賴模式促進THP-1源性巨噬細胞膽固醇外排至ApoA Ⅰ、HDL2和HDL3。2.Sal B對THP-1源性巨噬細胞ABCA1在蛋白和mRNA水平表達的影響：不同濃度的Sal B (0,0.1,1 and 10μM)處理THP-1源性巨噬細胞24h。與對照組比較,0.1μM Sal B處理THP-1源性巨噬細胞后ABCA1蛋白和mRNA水平表達無明顯改變,而1μM(P0.05)和10μM(P0.01)Sal B處理后,ABCA1蛋白和mRNA水平表達均明顯提高。用10μM Sal B處理THP-1巨噬細胞0、3、6、12、24 h。結(jié)果顯示,與對照組比較,10μM Sal B處理3h和6h對ABCA1蛋白水平表達無明顯影響(P0.05). 10μM Sal B刺激12h和24h ABCA1蛋白水平表達明顯升高(P0.01)。ABCA1 mRNA水平表達在10μM Sal B處理達6h后明顯升高(P0.01)。上述結(jié)果表明,Sal B可以濃度和時間依賴模式增強THP-1巨噬細胞ABCA1在蛋白水平和mRNA水平的表達。3. Sal B對THP-1源性巨噬細胞PPAR-γ和LXRa在蛋白水平表達的影響：不同濃度的Sal B (0,0.1,1 and 10μM處理THP-1源性巨噬細胞24h。與對照組比較,1μM和10μM Sal B處理后PPAR-γ和LXRa的表達顯著增加(P0.01); 0.1μM Sal B處理后PPAR-γ和LXRα的表達無明顯改變(P0.05)。4. PPAR-γ和LXRa激動劑及拮抗劑對Sal B誘導THP-1源性巨噬細胞ABCA1表達的影響：PPAR-γ拮抗劑GW9662和LXRa拮抗劑GGPP (20μM)均顯著抑制Sal B誘導的ABCA1在蛋白和mRNA水平的表達(P0.01),而PPAR-y激動劑羅格列酮(1μM)和LXRa激動劑GW3965 (5μM)大大增強ABCA1在蛋白和mRNA水平的表達(P0.01)。5. PPAR-γ和LXRa激動劑及拮抗劑對Sal B誘導荷脂的THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出的影響：PPAR-γ和LXRα激動劑及拮抗劑分別與Sal B共同孵育負載膽固醇的THP-1源性巨噬細胞24h。與對照組比較,Sal B顯著促進膽固醇流出至ApoA I (P0.01)、HDL2(P0.01)和HDL3 (P0.05)。PPAR-γ拮抗劑 GW9662和LXRα拮抗劑GGPP均明顯抑制Sal B誘導的膽固醇流出(P0.01)。PPAR-γ激動劑羅格列酮和LXRβ激動劑GW3965均明顯增強Sal B誘導膽固醇流向ApoA I、HDL2和HDL3 (P0.01)。結(jié)論1. Sal B可以時間和濃度依賴模式促進體外培養(yǎng)的負載膽固醇的THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出。2. Sal B可以濃度和時間依賴模式增強THP-1巨噬細胞ABCA1在蛋白水平和mRNA水平的表達。3. Sal B促進THP-1源性巨噬細胞ABCA1表達是通過PPAR-γ和LXRa途徑。4. Sal B誘導負載膽固醇的THP-1源性巨噬細胞膽固醇的流出是通過ABCA1/PPAR-γ/LXRa途徑。
【關鍵詞】：膽固醇逆轉(zhuǎn)運 丹酚酸B ABCA1 PPAR-γ 肝X受體
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 符號說明17-18
• 前言18-22
• 實驗材料22-24
• 實驗方法24-32
• 結(jié)果32-34
• 討論34-38
• 結(jié)論38-39
• 附圖表39-43
• 參考文獻43-49
• 綜述49-60
• 參考文獻56-60
• 致謝60-61
• 攻讀學位期間的研究成果61-62
• 外文論文62-98
• 學位論文評閱及答辯情況表98

【共引文獻】

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本文編號：341141