本文關鍵詞：Nrf2對NAFLD模型鼠Cyp2a5增量表達的調(diào)控機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一類沒有過量飲酒,病理學特征卻與酒精性脂肪性肝病(AFLD)相似,表現(xiàn)為肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積的臨床綜合征。NAFLD疾病譜從輕到重依次包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化四個的病理階段。NAFLD發(fā)病機制極為復雜,目前解釋該病發(fā)生機制的主要理論為“二次打擊”學說。盡管“二次打擊”學說的理論已經(jīng)被普遍接受,導致NAFLD的分子機理至今仍然不清楚。鼠Cyp2a5與人類的Cyp2a6在氨基酸序列上有同源性,在香豆素、尼古丁代謝及外源性藥物和致癌物的激活過程中發(fā)揮了重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)病毒性、細菌性及寄生蟲性肝炎等易誘發(fā)肝癌形成的肝臟疾病中Cyp2a5均是增量表達的。同時,小鼠NAFLD模型組中Cyp2a5的表達量也是升高的。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2,是細胞氧化應激反應中的關鍵因子,在肝損傷、脂肪肝、肝纖維化及肝癌等方面具有保護作用。本試驗以前期建立的NAFLD模型ICR鼠為試驗動物,探討非酒精性肝損傷時刺激Cyp2a5增量表達的病理生理學變化。再采用Nrf2基因敲除ICR鼠進行非酒精性肝損傷,研究Cyp2a5的表達量,確定Cyp2a5的增量表達是否依賴Nrf2通路,并研究分析Nrf2基因缺失對NAFLD的影響及其作用的分子機制,進一步闡明Cyp2a5在NAFLD損傷中的作用,闡明Nrf2通路在肝損傷時增量調(diào)節(jié)Cyp2a5中的作用;分析非酒精性肝損傷、Nrf2和Cyp2a5之間的相互作用。高脂飼料誘導8周后,野生型和基因缺失型小鼠血清學結果顯示,與對照組小鼠比較,野生型和基因缺失型NAFLD模型組小鼠TC、LDL、GLU、ALT和AST顯著升高(P0.01),ALP明顯升高(P0.01或P0.05),TP顯著降低(P0.01),但TG和HDL變化不明顯(P0.05);與野生型對照組小鼠比較,基因缺失型小鼠TC和ALP顯著升高(P0.01),HDL明顯升高(P0.05),TP均顯著降低(P0.01),ALT明顯降低(P0.05),但TG、LDL、GLU和AST變化不明顯(P0.05);與野生型NAFLD模型組小鼠比較,基因缺失型NAFLD模型組小鼠HDL和ALP顯著升高(P0.01),TG、和ALT明顯升高(P0.05),LDL均顯著降低(P0.01),TC和AST明顯降低(P0.05),但TP和GLU變化不明顯(P0.05)。肝臟病理學變化顯示,對照組小鼠(野生型對照WT-ND和基因缺失型對照KO-ND)肝臟無脂肪變性,小鼠肝細胞形態(tài)正常,肝索排列整齊,肝小葉結構正常,細胞中央有大而圓的核,無明顯脂肪滴,基本未見炎癥細胞。NAFLD模型組小鼠(野生型高脂誘導WT-HFD和基因缺失型高脂誘導KO-HFD)肝細胞核的相對大小不均,發(fā)生脂肪變性(小泡和大泡性脂肪變性)并伴有肝細胞壞死和炎性細胞浸潤。野生型高脂小鼠肝臟表現(xiàn)出小程度的小泡性脂肪變性,Nrf2基因缺失高脂小鼠肝臟表現(xiàn)出嚴重的大泡性脂肪變性和溫和的小泡性脂肪變性;油紅染色后,相比于WT-ND,KO-ND小鼠肝臟有少量的脂肪滴紅染;WT-HFD和KO-HFD小鼠肝臟有明顯的紅色脂肪滴。NAFLD對肝臟抗氧化能力和脂質(zhì)過氧化的影響結果顯示,高脂飼料誘導8周后,肝臟中的GSH、SOD、POD和MDA活性變化與對照組小鼠相比較,野生型和基因缺失型NAFLD模型組小鼠肝臟中GSH和SOD活性明顯降低(P0.05或P0.01),而POD和MDA活性明顯升高(P0.05或P0.01)。與野生型小鼠相比,基因缺失型NAFLD模型組小鼠肝臟中MDA活性增加49%,但GSH、SOD和POD變化不明顯(P0.05)。與野生型對照組小鼠相比,基因缺失型小鼠肝臟中SOD、POD和MDA明顯升高(P0.05或P0.01),而GSH活性顯著降低(P0.01)。同時,Nrf2下游相關靶基因變化結果顯示,與對照組小鼠相比較,野生型和基因缺失型NAFLD模型組小鼠,γ-GCS、Nqo1、GSTA1和HO-1 mRNA表達量明顯升高(P0.05或P0.01),而基因缺失型NAFLD模型組小鼠CAT和GCLC m RNA表達量沒有明顯變化(P0.05)。與野生型NAFLD模型組小鼠相比較,基因缺失型NAFLD模型組小鼠中所有Nrf2下游靶基因表達量明顯降低(P0.05或P0.01)。Western blot、免疫組化顯示,高脂誘導和脂肪酸誘導后,與對照組相比較,模型組肝細胞質(zhì)中Nrf2蛋白含量顯著降低(P0.01);肝細胞核中Nrf2蛋白含量顯著增加(P0.01),說明高脂飼料和脂肪酸誘導后Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)移。NAFLD對肝組織中Cyp2a5表達的影響結果顯示,與野生型NAFLD模型小鼠相比較,野生型對照組小鼠Cyp2a5蛋白表達量增加23%,差異顯著(P0.05);基因缺失型NAFLD模型小鼠與基因缺失型對照組小鼠相比較,小鼠肝臟Cyp2a5蛋白表達量增加13%;基因缺失型小鼠(NAFLD組和對照組)與野生型小鼠相比較,Cyp2a5蛋白表達量均顯著降低(P0.01)。與野生型NAFLD模型小鼠相比較,野生型對照組小鼠Cyp2a5酶活性增加35%,差異顯著(P0.01);基因缺失型NAFLD模型小鼠與基因缺失型對照組小鼠相比較,小鼠肝臟Cyp2a5酶活性增加16%;且基因缺失型小鼠肝臟Cyp2a5酶活性顯著低于野生型小鼠(P0.01);免疫組化結果顯示,在野生型對照組WT-ND小鼠中,肝細胞Cyp2a5的陽性表達量極少;經(jīng)高脂誘導后,WT-HFD小鼠肝臟中央靜脈周圍肝細胞中有明顯的Cyp2a5表達,表達量顯著高于WT-ND小鼠(P0.05)。在基因缺失對照組KO-ND小鼠中Cyp2a5表達量少;在KO-HFD小鼠中Cyp2a5有陽性表達,略高于的KO-ND小鼠,但無顯著性差異。綜合以上結果,表明高脂誘導Cyp2a5表達的過程中,Nrf2對其具有調(diào)節(jié)作用。免疫共沉淀檢測Nrf2與Cyp2a5蛋白之間的相互作用,結果表明,用anti-Nrf2的多克隆抗體能將Cyp2a5沉淀下來,用anti-Cyp2a5多克隆抗體同樣能沉淀下Nrf2,使用Ig G未檢測出條帶存在。通過8周的高脂誘導,與對照組相比較,NAFLD模型組小鼠肝臟中Nrf2和Cyp2a5蛋白表達含量明顯升高(P0.05或P0.01),這些結果表明,肝臟中Nrf2與Cyp2a5蛋白之間存在相互作用。本研究結果表明,高脂誘導肝臟氧化應激的發(fā)生與NAFLD疾病密切相關;在NAFLD疾病過程中,Nrf2激活下游抗氧化因子的表達,對肝臟起保護作用;Nrf2參與NAFLD疾病進程中Cyp2a5表達調(diào)控。
【關鍵詞】：非酒精性脂肪肝病 氧化應激 Cyp2a5 Nrf2 基因缺失
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.5;R-332
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 1 引言13-24
• 1.1 非酒精性脂肪肝病13-15
• 1.1.1 非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制13
• 1.1.2 氧化應激與非酒精性脂肪性肝病13-14
• 1.1.3 基因因素對非酒精性脂肪肝的影響14-15
• 1.2 Nrf2在非酒性脂肪肝中的作用15-20
• 1.2.1 肝脂質(zhì)代謝15-16
• 1.2.2 非酒精性脂肪肝的患病率及病因16
• 1.2.3 肝臟中Nrf2的活化16-17
• 1.2.4 Nrf2對肝臟的保護作用17-18
• 1.2.5 Nrf2對肝臟再生和衰老的影響18
• 1.2.6 Nrf2對肝臟脂質(zhì)代謝的影響18-19
• 1.2.7 Nrf2對非酒精性脂肪肝的影響19-20
• 1.3 Cyp2a520-23
• 1.3.1 Cyp2a5的誘導因素20-21
• 1.3.2 Cyp2a5的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)研究21-22
• 1.3.3 氧化應激與Cyp2a522
• 1.3.4 NAFLD與Cyp2a522-23
• 1.4 研究目的與意義23-24
• 2 材料與方法24-34
• 2.1 試驗材料24-27
• 2.1.1 試驗動物24
• 2.1.2 主要儀器設備24
• 2.1.3 藥品與試劑24-26
• 2.1.4 溶液配制26-27
• 2.2 試驗方法27-33
• 2.2.1 NAFLD小鼠模型的制備27-28
• 2.2.2 Nrf2基因缺失對NAFLD抗氧化能力和脂質(zhì)過氧化的影響28-29
• 2.2.3 Nrf2基因缺失對NAFLD模型鼠抗氧化基因m RNA表達量的影響29-30
• 2.2.4 NAFLD對肝組織細胞中Nrf2蛋白分布的影響30-32
• 2.2.5 Nrf2基因缺失對NAFLD中Cyp2a5表達的影響32
• 2.2.6 肝臟組織中Cyp2a5與Nrf2蛋白之間的相互作用32
• 2.2.7 肝臟組織免疫組化法檢測蛋白表達32-33
• 2.3 數(shù)據(jù)計算及統(tǒng)計分析33-34
• 3 結果與分析34-54
• 3.1 NAFLD小鼠模型的評價34-37
• 3.1.1 小鼠的NAFLD模型制備34
• 3.1.2 小鼠的血清學指標34-35
• 3.1.3 肝臟的病理學變化35-37
• 3.2 NAFLD對肝臟抗氧化能力和脂質(zhì)過氧化的影響37-40
• 3.3 NAFLD對Nrf2靶基因mRNA 表達量的影響40-44
• 3.4 NAFLD對肝組織細胞中Nrf2蛋白分布的影響44-46
• 3.4.1 肝組織細胞質(zhì)中Nrf2蛋白表達44-45
• 3.4.2 肝組織細胞核中Nrf2蛋白表達45-46
• 3.5 Nrf2基因缺失對NAFLD模型鼠肝組織中Cyp2a5表達的影響46-49
• 3.5.1 Nrf2基因缺失對NAFLD模型鼠肝組織中Cyp2a5蛋白表達的影響46-47
• 3.5.2 Nrf2基因缺失對NAFLD模型鼠肝組織中Cyp2a5基因表達的影響47-48
• 3.5.3 Nrf2基因缺失對NAFLD模型鼠肝組織中Cy P2a5酶活性的影響48-49
• 3.6 肝臟中Nrf2與Cyp2a5蛋白之間的相互作用49-52
• 3.7 免疫組化法檢測肝臟組織中蛋白表達含量52-54
• 3.7.1 免疫組化法檢測肝臟組織中Nrf2蛋白表達含量52
• 3.7.2 免疫組化法檢測肝臟組織中Cyp2a5蛋白表達含量52-54
• 4 討論54-59
• 4.1 NAFLD模型的復制54-55
• 4.2 Nrf2基因缺失對下游靶基因及NAFLD的影響55-56
• 4.3 Cyp2a5的轉(zhuǎn)錄調(diào)控56-57
• 4.4 病理學變化對Cyp2a5的表達的影響57
• 4.5 Nrf2基因缺失對Cyp2a5的表達影響57-58
• 4.6 Nrf2與Cyp2a5蛋白之間的相互作用58-59
• 5 結論59-60
• 致謝60-61
• 參考文獻61-79
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文79

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 R Scott Rector;John P Thyfault;Jamal A Ibdah;;Nonalcoholic fatty liver disease and mitochondrial dysfunction[J];World Journal of Gastroenterology;2008年02期

2 Veronika Zámbó;Laura Simon-Szabó;Péter Szelényi;，

本文編號：341182