發(fā)布時間：2017-04-24 17:40

  本文關(guān)鍵詞：腸上皮細胞Syndecan-1在維持腸粘膜屏障中的作用及機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的腸粘膜屏障是機體屏障系統(tǒng)的重要組成部分,多種因素可以引起腸粘膜屏障功能受損,導(dǎo)致腸壁通透性增加,細胞旁細胞轉(zhuǎn)運被易化,進一步誘發(fā)細菌易位、內(nèi)毒素血癥甚至是全身性炎癥反應(yīng)綜合征和多臟器功能衰竭綜合征。正常的腸粘膜屏障功能由腸粘膜上皮屏障(或稱為機械屏障)、免疫屏障、微生物屏障、化學(xué)屏障等組成,其中腸粘膜上皮屏障和免疫屏障被認為是最關(guān)鍵的組成部分。腸上皮屏障由完整的腸上皮細胞、細胞間封閉的緊密連接和粘附連接組成,是腸粘膜物理結(jié)構(gòu)的解剖屏障。封閉的緊密連接是腸上皮細胞之間的主要連接方式,被認為是上皮屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),是維持腸粘膜屏障通透性的決定因素。緊密連接的關(guān)鍵成分包括跨膜蛋白occludin(閉鎖蛋白)、claudins(密蛋白)家族等、膜周蛋白zonula occludens(閉鎖小帶,ZO),以及調(diào)節(jié)蛋白如激酶、磷酸化酶等多種蛋白。ZO-1 (zonula occludens-1)被認為是緊密連接的支架蛋白,具有PDZ樣結(jié)合位點(PSD-95、Discs large、Zona ocludens 1)、Src同源SH3結(jié)構(gòu)域(Src homology 3)和GUK鳥苷酸激酶樣(Guanylate kinase-like)結(jié)一構(gòu)域等結(jié)構(gòu),能夠連接occludin、claudins蛋白和細胞骨架肌動蛋白及肌球蛋白,在一系列信號分子的調(diào)控下,構(gòu)成穩(wěn)定的連接系統(tǒng),封閉細胞之間的間隙。正常情況下,緊密連接在相鄰上皮細胞間維持著正常的結(jié)構(gòu)組裝和功能狀態(tài),只允許離子及小分子可溶性物質(zhì)通過,而不允許毒性大分子和細菌等微生物通過,從而維持腸上皮屏障功能的完整。目前已經(jīng)明確,腸道內(nèi)的各種細菌、毒素及某些炎癥因子可通過不同途徑影響緊密連接的完整性和通透性,破壞腸粘膜屏障功能。然而近期有研究提示緊密連接單獨表達缺失或功能障礙并不足以破壞屏障而引起腹腔感染、敗血癥及多臟器功能衰竭等疾病,表明仍然存在其它因素參與腸上皮屏障功能的維護。Syndecan-1(CD138, Sdcl)屬于跨膜蛋白聚糖類細胞粘附分子,是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的重要成員。生理情況下多表達于成熟上皮細胞基底層,是細胞質(zhì)膜、細胞間質(zhì)的重要組成部分,由胞內(nèi)段、跨膜的核心蛋白和連接于核心蛋白上的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate, HS)鏈及硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS)鏈組成。它可以與多種配體結(jié)合,包括粘附分子、細胞外基質(zhì)、細胞因子、生長因子、趨化因子和細菌表面的肝素結(jié)合蛋白等,以共受體的方式在維持細胞形態(tài)、促進組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫功能、參與宿主防御等諸多病理生理過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)Sdcl為穩(wěn)固腸上皮屏障所必需,是維持上皮屏障的重要保護機制之一。其HS鏈及類似物乙酰肝素能夠抑制多種腸道菌種對腸上皮細胞的粘附,進而抑制細菌被內(nèi)吞入細胞、發(fā)生易位甚至引起系統(tǒng)性感染。Sdcl還能夠抑制葡萄球菌腸毒素感染性休克時細胞因子的級聯(lián)反應(yīng)和T細胞介導(dǎo)的炎性損傷,保護宿主抵抗全身敗血癥的發(fā)生。Sdcl與緊密連接蛋白均為上皮屏障功能的保護因素,但二者之間是否存在相互作用,是否能夠共同參與維持腸上皮屏障的過程現(xiàn)在并不十分明確。我們推測：Sdc1和緊密連接蛋白均參與腸上皮屏障功能的維護,二者可能具有協(xié)同作用,共同穩(wěn)固細胞旁屏障,保持細胞旁路物質(zhì)轉(zhuǎn)運的選擇性。為了證明這一假設(shè),本研究通過利用體外Transwell小室培養(yǎng)法模擬的單層腸上皮模型和體內(nèi)硫酸葡聚糖鈉(Dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)構(gòu)建的腸上皮屏障缺陷小鼠模型,探討了Sdc1與緊密連接蛋白的相互作用在腸上皮屏障功能維護中的作用；并進一步揭示了轉(zhuǎn)錄因子Stat3在這一過程中的介導(dǎo)作用。研究方法和結(jié)果1.篩選Sdcl不同表達水平的腸上皮細胞,構(gòu)建單層腸上皮屏障障模型采用熒光定量PCR、Western blot和免疫熒光法檢測四種經(jīng)文獻報道,具有形成融合性單層上皮潛能的結(jié)腸癌上皮細胞株(HT29、LoVo、SW480、Caco-2)細胞中的Sdcl的表達水平,結(jié)果提示Sdcl在HT29細胞中為顯著高表達(F=103.111,P0.001),并且大多集中于細胞膜上,而Caco-2細胞中的Sdcl表達水平最低。因此選取這兩種細胞用于構(gòu)建單層腸上皮屏障模型,采用跨膜電阻儀檢測上皮跨膜電阻(transepithelial electrical resistance, TEER)來評價上皮屏障的完整性,在大腸桿菌刺激后檢測細菌易位,通過熒光素FITC-dextran (FD4)的旁細胞轉(zhuǎn)運評價上皮屏障的通透性。結(jié)果顯示：在Transwell小室底部內(nèi)側(cè)培養(yǎng)細胞15d之后,TEER值顯著升高,約為300 ohms cm2,證明單層腸上皮屏障形成。大腸桿菌刺激后,以處理前TEER值為對照,TEER實測值的絕對值及其與處理前TEER值的比值均呈現(xiàn)時間依賴性的減少,而在未被細菌處理的上皮屏障中TEER值基本維持穩(wěn)定。在Caco-2細胞構(gòu)建的單層上皮屏障中,TEER值減少更加顯著(F=49.030,P0.001),大腸桿菌的易位量(t=8.373,P=0.001)和FD4的透過量(t=9.689,P=0.001)也均較HT29細胞更加顯著。為了明確上述屏障功能改變是否依賴于緊密連接蛋白的變化,在細菌刺激過程同時檢測腸上皮細胞是否會因細胞毒性反應(yīng)發(fā)生細胞膜損傷、細胞凋亡,以及是否發(fā)生緊密連接結(jié)構(gòu)的重組。結(jié)果顯示：大腸桿菌刺激細胞5h后,與未處理細胞比較,LDH釋放、caspase-3激活均并不顯著,而分別以Triton X-100 (HT29細胞：t=9.362,P=0.001; Caco-2細胞：t=12.566,P0.001)及環(huán)孢菌素A(Cyclosporin A, CsA)為陽性對照的處理組均表現(xiàn)出顯著的細胞損傷。正常細胞未受到細菌刺激時,免疫熒光染色可見ZO-1呈典型的線性熒光,沿細胞膜分布；大腸桿菌刺激細胞5h后,ZO-1熒光信號減弱,并且分布丟失明顯的規(guī)律性。上述結(jié)果說明在采用Transwell小室構(gòu)建單層上皮屏障模型的過程中,利用細菌刺激細胞5 h,細胞毒性反應(yīng)并不顯著,所發(fā)生的屏障功能的改變可能與緊密連接改變有關(guān),而與細胞凋亡或壞死的關(guān)系不顯著。2.Sdc1能緩解大腸桿菌刺激后的屏障功能受損及細菌易位利用慢病毒載體將外源性的Sdc1導(dǎo)入Caco-2細胞,經(jīng)過2周左右2 μg/mL puromycin篩選,建立了Sdc1表達顯著升高的細胞克隆,通過熒光定量PCR和Western blot對細胞克隆進行鑒定,結(jié)果顯示Sdcl在mRNA (t=14.381, P0.001)和蛋白水平均顯著增加。利用Lipofectmine 2000瞬時轉(zhuǎn)染Sdcl siRNA進入HT29細胞,轉(zhuǎn)染48 h后,Sdc1在mRNA (t=56.292, P0.001)和蛋白的表達水平均顯著降低。分別利用經(jīng)過上述處理的細胞構(gòu)建單層上皮屏障模型,檢測屏障功能變化。結(jié)果顯示,對Caco-2細胞上調(diào)Sdc1表達后,TEER值減低率(F=39.841,P0.001)、大腸桿菌易位(F=73.726,P0.001)、FD4透過值(F=54.835,P0.001)均顯著升高。與之相反,HT29細胞下調(diào)Sdc1表達后,TEER值減低率(F=34.098,P0.001)、大腸桿菌易位(F=33.782,P=0.001)、FD4透過值(F=153.383,P0.001)均顯著升高。以上結(jié)果提示Sdc1對上皮屏障功能可能具有保護作用。3.Sdc1能緩解金黃色葡萄球菌刺激后的屏障功能受損及細菌易位利用金黃色葡萄球菌刺激上述已經(jīng)構(gòu)建好的單層上皮屏障,結(jié)果顯示,刺激5h后,與對照組相比,高表達Sdc1的Caco-2細胞的TEER值減低率(F=129.269,P0.001)和葡萄球菌易位(F=39.479,P0.001)均顯著減少：而敲低Sdc1表達的HT29細胞中,TEER值減低率(F=124.132,P0.001)和葡萄球菌易位(F=51.965,P=0.001)均顯著增加,均與大腸桿菌刺激屏障后的結(jié)果一致。以上結(jié)果提示Sdc1對上皮屏障功能的保護作用并非呈刺激細菌依賴性,而可能是一種對各種細菌-上皮作用普遍存在的現(xiàn)象。4.Sdc1能夠減輕緊密連接蛋白缺陷細胞的屏障功能受損HT29細胞單獨轉(zhuǎn)染ZO-1 siRNA后,ZO-1蛋白表達水平顯著下降,若在此基礎(chǔ)上同時給予Sdcl慢病毒載體處理使Sdc1表達水平升高,就能夠顯著減弱ZO-1蛋白的下降程度。在上述ZO-1蛋白缺陷的細胞中檢測Sdc1表達改變前后屏障功能的變化,結(jié)果顯示：在HT29細胞單獨轉(zhuǎn)染ZO-1 siRNA下調(diào)ZO-1蛋白表達水平后,與對照組相比,單層上皮屏障的TEER值減低率(F=138.489,P0.001)、大腸桿菌易位(t=11.624, P0.001)、FD4透過值(t=14.802,P0.001)均顯著升高。若同時給予Sdcl慢病毒載體處理使ZO-1沉默作用被減輕,上述指標升高的程度均有所減少,提示受損的屏障功能被部分恢復(fù),Sdc1可能對ZO-1蛋白缺陷的細胞具有保護作用。但與單獨感染Sdc1慢病毒載體上調(diào)Sdc1表達水平,而對ZO-1蛋白不作專門處理的細胞相比,上述指標仍然有所下降,單層上皮屏障的功能仍然較低。HT29細胞單獨給予occludin siRNA或同時給予occludin siRNA和Sdcl慢病毒載體聯(lián)合處理后,結(jié)果表現(xiàn)出同樣的趨勢。以上結(jié)果提示Sdcl對于ZO-1或occludin蛋白缺陷細胞的屏障功能同樣具有保護作用,并且能夠減輕由于緊密連接損失導(dǎo)致的屏障功能受損。5.Sdc1能夠緩解小鼠體內(nèi)DSS誘導(dǎo)的屏障缺陷及細菌易位利用DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的方法構(gòu)建腸粘膜屏障缺陷小鼠模型,通過尾靜脈注射Sdc1高表達質(zhì)粒的方法進行體內(nèi)轉(zhuǎn)染,上調(diào)Sdc1表達,之后評估腸粘膜緊密連接蛋白表達及超微結(jié)構(gòu)、組織細菌易位、腸粘膜組織病理學(xué)變化等相應(yīng)屏障功能的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PBS對照組小鼠一般情況及大便性狀均無顯著變化,DAI評分為0；組織病理學(xué)檢查和緊密連接超微結(jié)構(gòu)亦無顯著改變。小鼠飲用DSS溶液3-5天后逐漸出現(xiàn)腹瀉、不同程度的稀便至血便等癥狀,DAI評分升高(F=559.328,P0.001),結(jié)腸縮短。肉眼觀察結(jié)腸組織,可見結(jié)腸縮短,受累腸段變紫紅至黑褐色,腸壁充血、水腫,與周圍組織粘連,部分可見糜爛及潰瘍。組織病理學(xué)可見腸粘膜不完整,可見多灶性淺潰瘍,杯狀細胞減少,隱窩及腺體正常結(jié)構(gòu)消失,部分病灶表面僅殘留少許上皮或上皮結(jié)構(gòu)已被完全破壞,粘膜層及粘膜下層大量炎性細胞浸潤。電鏡觀察可見緊密連接結(jié)構(gòu)減少、間隙增寬。提取腸粘膜蛋白進行Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)Sdcl及ZO-1、occludin蛋白的表達水平均減少。與DSS對照組相比,對小鼠進行尾靜脈注射Sdc1表達質(zhì)粒上調(diào)Sdc1表達后,小鼠結(jié)腸病變有所減輕,疾病活動度和結(jié)腸炎癥程度減低(DAI評分：F=559.328,P0.001),結(jié)腸縮短和體重下降程度亦不及對照組顯著；肉眼觀察可見腸管充血、水腫,但糜爛和潰瘍較少,病理組織學(xué)檢查可見有少量上皮細胞和腺體細胞再生并移行；電鏡觀察可見緊密連接結(jié)構(gòu)較完整,細胞間隙擴大程度有所減低；ZO-1、occludin蛋白的表達水平也有所增加。說明Sdcl在體內(nèi)對腸粘膜上皮屏障同樣具有保護作用。并且在DSS誘導(dǎo)前通過尾靜脈注射Sdcl進行預(yù)處理產(chǎn)生的效果較DSS誘導(dǎo)后注射Sdcl進行處理的效果更顯著(DAI評分：F=559.328,P0.001),提示Sdc1可能具有預(yù)防腸粘膜屏障缺陷產(chǎn)生的作用。而尾靜脈注射pcDNA3.0空白對照質(zhì)粒后小鼠結(jié)腸炎癥癥狀與DSS對照組相比差別并不顯著。提取不同處理組小鼠腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾組織樣本的基因組DNA進行熒光定量PCR檢測,計算其中的細菌含量。PBS對照組小鼠的腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾組織無細菌易位發(fā)生。與PBS對照組相比,單純DSS處理組小鼠腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾樣本中的細菌16S rDNA含量升高,菌群檢測為陽性,發(fā)生細菌易位。并且在DSS處理組內(nèi),從腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾中檢測到的細菌含量呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(P0.05)。在腸系膜淋巴結(jié)檢測到的細菌中,以腸球菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬為主,其次分別為梭菌屬和腸桿菌屬。在肝臟檢測到的細菌中,腸桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬較多,其次為腸球菌屬和雙歧桿菌屬。在脾臟檢測到的是腸球菌屬和腸桿菌屬。在三種組織中,均未檢測到乳酸桿菌屬的細菌。尾靜脈注射Sdcl質(zhì)粒上調(diào)Sdcl表達水平后,三種組織中的菌群總數(shù)和各亞屬的數(shù)量均呈現(xiàn)減少的趨勢(P0.05),尤其以脾臟最為顯著,在脾臟中均未檢測到任何細菌。以上結(jié)果提示Sdcl能夠抑制體內(nèi)屏障缺陷模型的細菌易位。6.Sdcl與緊密連接蛋白ZO-1、occludin在細胞中的表達及分布相似利用免疫熒光染色從細胞水平觀察Sdc1與ZO-1、occludin的細胞內(nèi)定位,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sdcl和ZO-1、occludin分布位置相似,均以細胞膜上分布為主。Caco-2細胞上調(diào)Sdcl表達后,Western blot檢測結(jié)果提示ZO-1和occludin的表達水平均升高；HT29細胞敲除Sdc1表達后,ZO-1和occludin的表達水平也均有一定程度的降低。7.Sdcl通過激活Stat3信號通路調(diào)控ZO-1和occludin的表達在高表達Sdcl的細胞中,Stat3發(fā)生705位酪氨酸磷酸化修飾,提示Stat3信號通路被激活。利用IL-6刺激HT29細胞誘導(dǎo)Stat3通路被激活,或通過帶有Stat3持續(xù)活化型質(zhì)粒的慢病毒載體感染細胞誘導(dǎo)Stat3通路的持續(xù)活化后,ZO-1(F=5471.716,P0.001)和occludin (F=151.487, P0.001)的表達均顯著增高,mRNA和蛋白水平的變化保持一致,并且與Sdcl高表達細胞中ZO-1和occludin的改變一致。通過感染帶有Stat3顯性負性突變型質(zhì)粒的慢病毒載體阻斷Stat3的轉(zhuǎn)錄活性后,細胞中ZO-1和occludin的表達水平均減少(P0.001)。如果在阻斷Stat3轉(zhuǎn)錄活性同時再感染Sdc1慢病毒載體上調(diào)Sdcl表達,Sdc1對ZO-1和occludin的表達調(diào)控作用就被削弱,提示Sdcl是通過Stat3通路的介導(dǎo)從而發(fā)揮對ZO-1和occludin的調(diào)控作用的。8. Stat3信號通路參與Sdcl對腸上皮屏障功能的維護在細胞中阻斷Stat3轉(zhuǎn)錄活性的同時上調(diào)Sdcl的表達水平,檢測Sdcl表達水平改變前后腸上皮單層屏障模型的功能變化。結(jié)果提示：單獨阻斷Stat3的轉(zhuǎn)錄活性,單層上皮屏障功能受損,表現(xiàn)為TEER值下降(F=83.270,P0.001),大腸桿菌易位(t=3.954,P=0.017)及FD4透過增加(t=11.143,P0.001)。盡管Sdcl能夠維持細胞的TEER值在較高水平,抑制細菌易位和FD4的跨膜轉(zhuǎn)運,但當Stat3通路被阻斷時,Sdcl的上述保護作用就被削弱。9. Stat3能直接結(jié)合ZO-1和occludin的啟動子生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)：在人類ZO-1和occludin基因及其轉(zhuǎn)錄起始位點上游約10 kb以內(nèi)的DNA序列中,可以找到多個類似Stat3結(jié)合核心序列(TTCCGGAA)的DNA序列,被認為是潛在的Stat3的DNA結(jié)合位點,隨后利用ChIP實驗驗證其是否位于ZO-1或occludin的啟動子區(qū)域。結(jié)果提示：在ZO-1轉(zhuǎn)錄起始位點上游-199～-208 bp、-394--404 bp處,occludin轉(zhuǎn)錄起始位點上游-4458■4469 bp、-5385-5394 bp、-7056-7066 bp處分別找到若干個與Stat3分子DNA結(jié)合序列最相似的序列,ChIP-PCR顯示ZO-1和occludin基因的啟動子序列通過Stat3-ChIP得到了富集(P0.05),證明Stat3可以與ZO-1和occludin的啟動子結(jié)合。當Caco-2細胞高表達Sdcl時,Stat3向ZO-1和occludin啟動子區(qū)域的募集顯著增加(P0.01)。在HT29細胞中敲除Sdcl后,Stat3的募集相對減少(P0.01)。這些結(jié)果表明,Sdc1能夠激活Stat3分子發(fā)生磷酸化,Stat3能夠直接靶向結(jié)合ZO-1和occludin的啟動子,三者表達水平呈正相關(guān)。對結(jié)果5所述的動物實驗中的腸粘膜蛋白進行Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射Sdc1表達質(zhì)粒組小鼠的腸粘膜中Sdc1及ZO-1、occludin蛋白表達水平增加的同時,Stat3信號通路也被激活,Stat3分子被顯著磷酸化,體內(nèi)、外結(jié)果保持一致。10. ZO-1與occludin具有相互作用,反饋調(diào)節(jié)Sdc1表達Co-IP實驗提示免疫沉淀的ZO-1復(fù)合體中可以檢測到occludin蛋白的存在,同樣,在免疫沉淀的occludin復(fù)合體中也可以檢測到ZO-1蛋白的存在；而ZO-1和occludin與作為陰性對照的IgG蛋白不發(fā)生任何結(jié)合作用,表明ZO-1和occludin二者能夠發(fā)生相互作用,構(gòu)成免疫復(fù)合體。在HT29細胞中,敲除ZO-1或occludin蛋白,Sdc1的表達水平呈反饋性增加。提示三者可能構(gòu)成負反饋環(huán)路,共同參與對腸上皮屏障功能的維持。結(jié)論1、Sdc1對腸上皮屏障的維護具有保護作用,表現(xiàn)為能夠顯著穩(wěn)定上皮的完整性、抑制細菌易位和降低跨膜轉(zhuǎn)運的通透性；2、Sdcl能夠在體外提高緊密連接蛋白缺陷細胞的單層上皮屏障功能；3、Sdcl能夠在體內(nèi)緩解DSS誘導(dǎo)的屏障缺陷及細菌易位；4、Sdcl與緊密連接蛋白ZO-1、occludin在細胞中的表達同步、分布相似；5、Sdcl能夠激活Stat3信號通路,磷酸化的Stat3直接結(jié)合ZO-1和occludin的啟動子區(qū)域,調(diào)控ZO-1和occludin的轉(zhuǎn)錄,從而參與Sdc1對屏障功能的維護；6、ZO-1與occludin具有相互作用,構(gòu)成免疫復(fù)合體,能負反饋調(diào)節(jié)Sdc1表達,共同構(gòu)成環(huán)路維護屏障功能保持正常。
【關(guān)鍵詞】：腸粘膜屏障 緊密連接 Syndecan-1 Stat3信號通路 細菌易位
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R574
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-20
• 第一部分 Syndecan-1與緊密連接蛋白ZO-1、occludin在維護腸上皮屏障中的作用20-70
• 1. 前言20-24
• 2. 實驗材料24-27
• 3 實驗儀器27-28
• 4 實驗方法28-40
• 5 結(jié)果40-67
• 6 討論67-70
• 第二部分 Syndecan-1通過激活Stat3通路調(diào)控緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達和功能70-94
• 1 前言70-71
• 2 實驗材料71-75
• 3 實驗方法75-79
• 4 結(jié)果79-91
• 5 討論91-94
• 全文小結(jié)94-95
• 參考文獻95-102
• 中英文縮略詞對照表102-104
• 綜述104-113
• 參考文獻110-113
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文113-114
• 致謝114-117
• 統(tǒng)計學(xué)證明117

  本文關(guān)鍵詞：腸上皮細胞Syndecan-1在維持腸粘膜屏障中的作用及機制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：324652