脫氧膽酸對(duì)C57BL/6小鼠回腸類器官生長(zhǎng)和屏障功能的影響
發(fā)布時(shí)間：2021-03-30 04:51
目的:·建立小鼠小腸類器官（Enteroids）培養(yǎng)系統(tǒng),證明脫氧膽酸影響小腸類器官生長(zhǎng)和屏障功能,并進(jìn)一步探討其機(jī)制。方法:取C57BL/6小鼠末段回腸,EDTA法分離,收集隱窩后Matrigel基質(zhì)膠包埋,于完整培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以無(wú)水酒精和正常Enteroids為對(duì)照,予100μmol/L高濃度DCA短期干預(yù)2 d,10 μmol/L DCA長(zhǎng)期干預(yù)10 d,并去除DCA后再長(zhǎng)期培養(yǎng)10 d,光鏡下觀察Enteroids的生長(zhǎng)情況,FD-4實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Enteroids通透性變化,透射電鏡觀察Enteroids上皮細(xì)胞和細(xì)胞間連接的形態(tài)學(xué)變化。應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)低濃度DCA長(zhǎng)期干預(yù)Enteroids后其基因表達(dá)譜的變化,應(yīng)用熒光定量PCR和免疫印跡等檢測(cè)其中緊密連接相關(guān)的Occludin和MLCK以及ERK和Tcf4的表達(dá)變化。結(jié)果:（1）成功建立小鼠回腸類器官體外培養(yǎng)系統(tǒng),所觀察到的Enteroids形態(tài)特點(diǎn)與文獻(xiàn)一致。（2）高濃度DCA短期干預(yù)Enteroids,腸道類器官Enterospheres形成率、Enteroids形成率、類器官演化率和出芽數(shù)量均明顯減少（P<0.0...
【文章來(lái)源】：南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省
【文章頁(yè)數(shù)】：129 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【部分圖文】：
圖１小鼠腸道類器官光鏡下照片，示意圖及３Ｄ重建圖??注：示意圖中綠色細(xì)胞表示潘氏細(xì)胞，紫色細(xì)胞表示腸道干細(xì)胞，粉色細(xì)胞為其他腸道上??
?南京醫(yī)科大學(xué)博±學(xué)位論文??洗涂后再次離屯、，過(guò)程同２．３，去除上清液后，Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ沉淀物懸浮于少量ＡＤＦ??培養(yǎng)液中，按２．２過(guò)程鋪１２孔板進(jìn)行培養(yǎng)。??３結(jié)果??我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中成功建立了?Ｃ５７ＢＬ／６小鼠回腸類器官培養(yǎng)系統(tǒng)［ｉｓ］，并在光鏡??下觀察整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ的形態(tài)變化。??我們采用整合劑ＥＤＴＡ和物理分離相結(jié)合的方法來(lái)分離回腸粘膜的隱窩。??小鼠回腸隱窩分離時(shí)，從小腸隱窩底部到隱窩中部或者整個(gè)隱窩的所有上皮細(xì)??胞均被分離下來(lái)，而間質(zhì)細(xì)胞如肌成纖維細(xì)胞、纖維母細(xì)胞或者平滑肌細(xì)胞等??則不包含在其中。剛被分離出的小腸隱窩呈現(xiàn)發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)（圖１Ａ），其中含有??２０個(gè)或者更多來(lái)自小腸隱窩底部的細(xì)胞。??
Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ形成率（６．３９％±２．９５％）和類器官演化率（１１餅％±５．０７％）與無(wú)水酒??精（７７．１６〇／〇±１．３０％和?８２．２３％±１．２６％）和正常?Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ?對(duì)照組（８０．６９％±３．７８〇／〇??和８５．２１％±１．９４％）比較明顯減少ＣＰ＜０．０５）（圖２?Ａ，Ｂ和Ｃ），說(shuō)明高濃度短??期ＤＣＡ干預(yù)Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ明顯影響了類器官Ｅｎｔｅｒｏｓｐｈｅｒｅｓ的形成和Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ的形??成。２?ｄ時(shí)的Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ出芽數(shù)量（０．２０±０．４１）也明顯少于無(wú)水酒精（３．３化１．３０）??和正常?Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ對(duì)照組（３．４０±１．４７，戶＜０．０５）（圖?ＩＡ，圖?２Ｄ）。??高濃度ＤＣＡ干預(yù)Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ?２?ｄ后去除ＤＣＡ，傳代后ｉＵ無(wú)ＤＣＡ的完全??ＡＤＦ培養(yǎng)液培養(yǎng)Ｅｎｔｅｒｏｉ化，光鏡下觀察ｌＯｄ時(shí)，類器官結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，但其周??圍仍有較多壞死細(xì)胞（圖１Ｇ），而無(wú)水酒精和正常Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ對(duì)照沮生長(zhǎng)良好。??去除ＤＣＡ恢復(fù)無(wú)ＤＣＡ的完全ＡＤＦ培養(yǎng)液培養(yǎng)Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ后１?ｄ時(shí)，??Ｅｎｔｅｒｏｓｐｈｅｒｅｓ?形成率（２３．９８％±０．５１％）仍明顯低于無(wú)水酒精（９０．４２％±４．８５％）??和正常Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ對(duì)照組（％．９６％±２刀５％於０．０５）
本文編號(hào)：3108895
【文章來(lái)源】：南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省
【文章頁(yè)數(shù)】：129 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【部分圖文】：
圖１小鼠腸道類器官光鏡下照片，示意圖及３Ｄ重建圖??注：示意圖中綠色細(xì)胞表示潘氏細(xì)胞，紫色細(xì)胞表示腸道干細(xì)胞，粉色細(xì)胞為其他腸道上??
?南京醫(yī)科大學(xué)博±學(xué)位論文??洗涂后再次離屯、，過(guò)程同２．３，去除上清液后，Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ沉淀物懸浮于少量ＡＤＦ??培養(yǎng)液中，按２．２過(guò)程鋪１２孔板進(jìn)行培養(yǎng)。??３結(jié)果??我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中成功建立了?Ｃ５７ＢＬ／６小鼠回腸類器官培養(yǎng)系統(tǒng)［ｉｓ］，并在光鏡??下觀察整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ的形態(tài)變化。??我們采用整合劑ＥＤＴＡ和物理分離相結(jié)合的方法來(lái)分離回腸粘膜的隱窩。??小鼠回腸隱窩分離時(shí)，從小腸隱窩底部到隱窩中部或者整個(gè)隱窩的所有上皮細(xì)??胞均被分離下來(lái)，而間質(zhì)細(xì)胞如肌成纖維細(xì)胞、纖維母細(xì)胞或者平滑肌細(xì)胞等??則不包含在其中。剛被分離出的小腸隱窩呈現(xiàn)發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)（圖１Ａ），其中含有??２０個(gè)或者更多來(lái)自小腸隱窩底部的細(xì)胞。??
Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ形成率（６．３９％±２．９５％）和類器官演化率（１１餅％±５．０７％）與無(wú)水酒??精（７７．１６〇／〇±１．３０％和?８２．２３％±１．２６％）和正常?Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ?對(duì)照組（８０．６９％±３．７８〇／〇??和８５．２１％±１．９４％）比較明顯減少ＣＰ＜０．０５）（圖２?Ａ，Ｂ和Ｃ），說(shuō)明高濃度短??期ＤＣＡ干預(yù)Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ明顯影響了類器官Ｅｎｔｅｒｏｓｐｈｅｒｅｓ的形成和Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ的形??成。２?ｄ時(shí)的Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ出芽數(shù)量（０．２０±０．４１）也明顯少于無(wú)水酒精（３．３化１．３０）??和正常?Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ對(duì)照組（３．４０±１．４７，戶＜０．０５）（圖?ＩＡ，圖?２Ｄ）。??高濃度ＤＣＡ干預(yù)Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ?２?ｄ后去除ＤＣＡ，傳代后ｉＵ無(wú)ＤＣＡ的完全??ＡＤＦ培養(yǎng)液培養(yǎng)Ｅｎｔｅｒｏｉ化，光鏡下觀察ｌＯｄ時(shí)，類器官結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，但其周??圍仍有較多壞死細(xì)胞（圖１Ｇ），而無(wú)水酒精和正常Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ對(duì)照沮生長(zhǎng)良好。??去除ＤＣＡ恢復(fù)無(wú)ＤＣＡ的完全ＡＤＦ培養(yǎng)液培養(yǎng)Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ后１?ｄ時(shí)，??Ｅｎｔｅｒｏｓｐｈｅｒｅｓ?形成率（２３．９８％±０．５１％）仍明顯低于無(wú)水酒精（９０．４２％±４．８５％）??和正常Ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ對(duì)照組（％．９６％±２刀５％於０．０５）
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