本文關(guān)鍵詞：miR-10b在人肝細(xì)胞肝癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制的初步探索，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【研究背景】肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一個(gè)多因素、多途徑的復(fù)雜病變過程,具有發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、死亡率高的特點(diǎn)。因此,盡快從分子水平闡明HCC的發(fā)病機(jī)制對(duì)預(yù)防、診斷和治療至關(guān)重要。探索染色體畸變和相關(guān)基因異常已成為腫瘤研究的重要切入點(diǎn)。其中,癌基因的過表達(dá)和抑癌基因的缺失或低表達(dá)是HCC發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),促進(jìn)了腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)性狀。因此,積極尋找新的診斷標(biāo)記物、發(fā)現(xiàn)有效的作用靶點(diǎn)、探索HCC的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制,越來越多的受到人們的關(guān)注。微小RNA(micro RNA)(以下簡(jiǎn)稱mi RNA)是一類由17-25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA分子,參與轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。成熟的mi RNA與RNA沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)形成RISC-mi RNA復(fù)合物。復(fù)合物與靶基因信使RNA(messenger RNA,m RNA)的3’-非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)不完全配對(duì)結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)。mi RNA具有組織、時(shí)序特異性,不同的腫瘤呈現(xiàn)出特異的mi RNA表達(dá)譜,這為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了新的可行的標(biāo)記物和治療干預(yù)靶點(diǎn)。目前,關(guān)于HCC相關(guān)mi RNA表達(dá)譜的研究越來越多,并且報(bào)道了一些與HCC鑒別診斷、預(yù)后評(píng)估、侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)的mi RNA,以此為臨床應(yīng)用提供新的、具有可行性和可操作性的科學(xué)依據(jù)。通過對(duì)文獻(xiàn)中的mi RNA表達(dá)譜篩選和查閱相關(guān)文獻(xiàn),我們發(fā)現(xiàn)mi R-10b在多種腫瘤組織中呈高表達(dá),但在HCC中的表達(dá)變化及功能研究相對(duì)匱乏。mi R-10b定位于2號(hào)染色體的HOX基因簇,推測(cè)其與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過相關(guān)生物信息學(xué)方法及軟件進(jìn)行搜索、比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)CSMD1(CUB and Sushi multiple domains 1)可能是mi R-10b的靶基因。CSMD1是一個(gè)單次跨膜蛋白,位于氨基端的胞外區(qū)包含CUB和Sushi結(jié)構(gòu)域,其功能可能與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-配體的相互作用有關(guān),并且該區(qū)域有信號(hào)肽的存在;位于羧基端的胞漿區(qū)由63個(gè)氨基酸殘基組成,有三個(gè)磷酸化位點(diǎn)。這表明CSMD1可能是膜受體或粘附因子,參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而參與HCC的發(fā)生、進(jìn)展。近年來的研究顯示,CSMD1是一個(gè)新候選的腫瘤抑制基因,但其在HCC中的研究極少。因此,我們首次在HCC中進(jìn)行了mi R-10b和CSMD1的相互關(guān)系及功能機(jī)制的研究,以闡明它們?cè)贖CC過程中的作用,從而為HCC的診斷和治療提供新的候選基因和作用靶點(diǎn)�！灸康摹繖z測(cè)mi R-10b在HCC組織中的表達(dá),并闡明mi R-10b與CSMD1在HCC中的相互關(guān)系及功能機(jī)制,為HCC的診斷和治療提供新的候選基因和作用靶點(diǎn)�！痉椒ā�1.利用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)檢測(cè)mi R-10b在HCC組織中的表達(dá)水平;2.利用q RT-PCR檢測(cè)mi R-10b在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平,篩選出mi R-10b表達(dá)與HCC組織相一致的細(xì)胞系;采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染mi R-10b mimic、inhibitor及各自相應(yīng)的陰性對(duì)照,分別進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn),并用流式細(xì)胞儀測(cè)定其對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響,觀察mi R-10b對(duì)細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響;3.采用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),在瘤內(nèi)多點(diǎn)注射agomir-10b及其陰性對(duì)照,觀察mi R-10b在體內(nèi)環(huán)境對(duì)腫瘤生長(zhǎng)性狀的影響;4.采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mi R-10b和CSMD1之間是否存在直接負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,并明確其結(jié)合位點(diǎn);利用q RT-PCR和免疫組化驗(yàn)證CSMD1和mi R-10b在m RNA水平和蛋白水平是否存在負(fù)向表達(dá)調(diào)控關(guān)系;5.采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染CSMD1的si RNA及其陰性對(duì)照,利用q RT-PCR和細(xì)胞免疫組化檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率后,進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn),觀察CSMD1對(duì)細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響;在免疫組化水平檢測(cè)臨床HCC病例中CSMD1的表達(dá)情況,分析CSMD1在HCC中的作用�！窘Y(jié)果】1.與非腫瘤肝組織相比,mi R-10b在HCC組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)(-1.4590±0.69542 vs.-1.7312±0.62758,p0.01),且mi R-10b的表達(dá)水平與患者年齡、HBV感染有相關(guān)性;2.MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mi R-10b促進(jìn)細(xì)胞增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mi R-10b促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲;流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示mi R-10b促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡;3.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,agomir-10b組腫瘤生長(zhǎng)更快,體積更大;4.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mi R-10b對(duì)CSMD1 3’UTR有直接負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,結(jié)合位點(diǎn)為707-713位點(diǎn);q RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示mi R-10b與CSMD1之間呈負(fù)表達(dá)調(diào)控關(guān)系;5.CSMD1的si RNA沉默效率達(dá)到70%左右,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CSMD1低表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖;Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CSMD1低表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲;與非腫瘤肝組織相比,臨床HCC中CSMD1呈低表達(dá)。【結(jié)論】1.與非腫瘤肝組織相比,mi R-10b在HCC中的表達(dá)顯著上調(diào),且mi R-10b上調(diào)的水平與患者年齡及HBV感染呈正相關(guān),提示mi R-10b可能與HCC發(fā)生有相關(guān);2.mi R-10b促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,并抑制肝癌細(xì)胞凋亡,且mi R-10b在體內(nèi)環(huán)境又促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng),提示mi R-10b在HCC發(fā)生中可能具有癌基因的功能;3.mi R-10b與HCC發(fā)生相關(guān)作用機(jī)制可能與mi R-10b負(fù)向調(diào)控CSMD1基因表達(dá)有關(guān),CSMD1在HCC中具有抑癌基因的功能;綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)mi R-10b與HCC發(fā)生相關(guān),其作用機(jī)制可能與mi R-10b負(fù)向調(diào)控CSMD1基因表達(dá)有關(guān)。研究結(jié)果為HCC病因及分子遺傳學(xué)研究提供了新的思路,也為HCC的個(gè)體化診斷提供了新的潛在分子標(biāo)志物。
【關(guān)鍵詞】：肝細(xì)胞肝癌 microRNA miR-10b CSMD1
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 縮略語表7-10
• 中文摘要10-14
• ABSTRACT14-18
• 前言18-20
• 文獻(xiàn)回顧20-35
• 1.HCC的發(fā)生及相關(guān)抑癌基因20-24
• 2.MIRNA的生物學(xué)特性及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用24-31
• 3.CSMD1在HCC中的研究進(jìn)展31-35
• 第一部分 MIR-10B在HCC中的表達(dá)以及臨床意義35-42
• 1 材料35-36
• 1.1 HCC組織樣本35-36
• 1.2 主要試劑36
• 1.3 主要儀器36
• 2 方法36-39
• 2.1 應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-10b在進(jìn)展期HCC中的表達(dá)36-39
• 3 結(jié)果39-41
• 3.1 RNA提取質(zhì)量鑒定39
• 3.2 q RT-PCR檢測(cè)miR-10b在HCC中的表達(dá)變化39-40
• 3.3 miR-10b在HCC中的表達(dá)水平與患者臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系40-41
• 4 討論41-42
• 第二部分 MIR-10B對(duì)肝癌細(xì)胞生物性狀的影響42-57
• 1 材料42-44
• 1.1 細(xì)胞系42
• 1.2 主要試劑42-43
• 1.3 主要儀器43-44
• 2 方法44-49
• 2.1 應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-10b在HL-7702、HepG2、SK-hep-1、Huh7中的表達(dá)情況44-45
• 2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染45-46
• 2.3 四甲基偶氮唑鹽比色法（3-(4,5-Dimethyl2thiazolyl)-2,5-diphenyl2H-tetrazolium bromide, MTT）實(shí)驗(yàn)46
• 2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)46-47
• 2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)47
• 2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)47
• 2.7 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)47-48
• 2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡48-49
• 2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法49
• 3 結(jié)果49-55
• 3.1 q RT-PCR檢測(cè)miR-10b在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)變化49
• 3.2 q RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率49-50
• 3.3 miR-10b對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響50-52
• 3.4 miR-10b對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響52-53
• 3.5 miR-10b對(duì)HepG2細(xì)胞周期和凋亡的影響53-55
• 4 討論55-57
• 第三部分 MIR-10B對(duì)裸鼠皮下成瘤的影響57-63
• 1 材料57-58
• 1.1 裸鼠57
• 1.2 細(xì)胞系57
• 1.3 主要試劑57-58
• 1.4 主要儀器58
• 2 方法58-60
• 2.1 agomir-10b對(duì)裸鼠皮下成瘤的影響58-59
• 2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法59-60
• 3 結(jié)果60-62
• 3.1 agomir-10b對(duì)裸鼠皮下成瘤的影響60-62
• 4 討論62-63
• 第四部分 MIR-10B與CSMD1靶向關(guān)系的研究63-83
• 1 材料63-65
• 1.1 細(xì)胞系63
• 1.2 載體63-64
• 1.3 主要試劑64
• 1.4 主要儀器64-65
• 2 方法65-75
• 2.1 3’UTR載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)65-71
• 2.2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)71-72
• 2.3 應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)CSMD1 mRNA水平72-73
• 2.4 細(xì)胞免疫組化73-74
• 2.5 組織免疫組織化學(xué)染色74
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法74-75
• 3 結(jié)果75-82
• 3.1 野生型和突變型載體構(gòu)建成功75-79
• 3.1.1 PCR擴(kuò)增目的基因CSMD13’UTR片段及5個(gè)菌落PCR鑒定結(jié)果75-79
• 3.2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果79
• 3.3 q RT-PCR檢測(cè)miR-10bmimic和inhibitor轉(zhuǎn)然后CSMD1表達(dá)變化79-80
• 3.4 細(xì)胞免疫組化檢測(cè)CSMD1表達(dá)變化80-81
• 3.5 組織免疫組化檢測(cè)CSMD1表達(dá)變化81-82
• 4 討論82-83
• 第五部分 CSMD1在肝癌細(xì)胞系和HCC中功能的初步探索83-92
• 1 材料84-85
• 1.1 細(xì)胞系84
• 1.2 組織樣本84
• 1.3 主要試劑84
• 1.4 主要儀器84-85
• 2 方法85-86
• 2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染85-86
• 2.2 q RT-PCR86
• 2.3 細(xì)胞免疫組織化學(xué)86
• 2.4 MTT實(shí)驗(yàn)86
• 2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)86
• 2.6 免疫組織化學(xué)86
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法86
• 3 結(jié)果86-90
• 3.0 siRNA和NC轉(zhuǎn)染后CSMD1mRNA表達(dá)變化86-87
• 3.1 siRNA和NC轉(zhuǎn)染后CSMD1蛋白表達(dá)變化87
• 3.2 MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響87-88
• 3.3 CSMD1 siRNA對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響88-89
• 3.4 CSMD1在HCC中免疫組化結(jié)果89-90
• 4 討論90-92
• 小結(jié)92-93
• 參考文獻(xiàn)93-109
• 附錄109-111
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果111-112
• 致謝112

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3 全弘揚(yáng);長(zhǎng)鏈非編碼RNA在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的相關(guān)作用及機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

4 胡亮;DDX19A識(shí)別PRRSV基因組RNA并激活NLRP3炎癥小體[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

5 張帥兵;應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對(duì)旋毛蟲Nudix水解酶基因功能的研究[D];鄭州大學(xué);2015年

6 鄭芳芳;肺癌RNA-Seq數(shù)據(jù)中RNA編輯事件的識(shí)別算法和系統(tǒng)分析[D];蘇州大學(xué);2015年

7 陳瑞東;長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2015年

8 劉駿武;線蟲和水稻中環(huán)狀RNA的預(yù)測(cè)及分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 李猷;利用RNA干擾技術(shù)提高番茄抗TMV侵染能力的研究[D];牡丹江師范學(xué)院;2015年

10 吳術(shù)盛;SVCV感染EPC細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：miR-10b在人肝細(xì)胞肝癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制的初步探索，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：306839