本文關(guān)鍵詞：脂肪間質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合β磷酸三鈣局部移植及系統(tǒng)應(yīng)用活性維生素D修復(fù)骨缺損的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：腫瘤、損傷及先天畸形導(dǎo)致的骨組織缺損一直是臨床醫(yī)生面臨的難題。多年來,學(xué)術(shù)界不斷探索針對骨組織缺損的修復(fù)方式,其中骨組織工程可謂是最有前景的治療手段之一。傳統(tǒng)的組織工程在修復(fù)骨缺損時,通常采用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作為工程細(xì)胞與支架材料結(jié)合移植到骨缺損中。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在成骨分化、分泌骨基質(zhì)及誘導(dǎo)礦化方面的能力毋庸置疑,但是將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞廣泛應(yīng)用于臨床治療尚存在一些不利因素,例如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的儲量非常有限,提取過程復(fù)雜且創(chuàng)傷大。因此,近年來,學(xué)者們開始嘗試探索其他來源的同樣具有多能分化潛質(zhì)的細(xì)胞來代替骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。這些細(xì)胞包括：脂肪間質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)、成肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、皮膚前體細(xì)胞、間皮細(xì)胞以及卵巢濾泡顆粒細(xì)胞等。他們具有干細(xì)胞性質(zhì)并可分化為三個胚層中任何一種細(xì)胞系。在這些細(xì)胞中,ADSC或許是最適合骨組織工程的細(xì)胞,因?yàn)樗隗w內(nèi)脂肪組織中存量相當(dāng)豐富,易于提取,收集過程創(chuàng)傷較小,且在體外生長迅速,對培養(yǎng)條件要求不高,經(jīng)過簡單的成骨分化誘導(dǎo)就可以快速地表達(dá)成骨細(xì)胞特異性蛋白。ADSC程梭形,與支架材料親和性高,經(jīng)成骨分化誘導(dǎo)后,可表達(dá)成骨細(xì)胞相關(guān)特異性標(biāo)記物如：堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原(ColⅠ)、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)、及runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2)等。除干細(xì)胞外,支架材料也是組織工程的重要組成要素,而骨組織工程應(yīng)用最廣泛的支架材料當(dāng)屬磷酸三鈣(TCP)。磷酸三鈣可分為兩個亞型即α-TCP和β-TCP。早期骨組織工程多選用α-TCP作為支架材料,然而與α-TCP相比,近來備受關(guān)注的β-TCP具有更好的組織相容性,以及更接近于新骨形成速率的降解率,并且降解后無任何殘留。β-TCP與ADSC共培養(yǎng)時,ADSC可在24小時內(nèi)覆蓋β-TCP表面95%的面積。另外,β-TCP還具有一定的誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的作用。組織工程最后一個重要構(gòu)成就是細(xì)胞因子,常用的細(xì)胞因子有骨形成蛋白2和7(BMP-2,BMP-7)等,BMP是一族生長因子家族,可調(diào)控骨及軟骨的形成,但BMP復(fù)合支架材料價格相對昂貴,難以在臨床廣泛應(yīng)用。多年來,1,25 (OH)2D3即維生素D體內(nèi)活性形式骨化三醇(calcitrol)及其類似物由于可以增加骨礦化密度(BMD)及相對低廉的價格,一直被用于治療骨質(zhì)疏松癥,而近年來研究發(fā)現(xiàn),成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞均有維生素D受體(VDR)的表達(dá)。我們推測,calcitrol及其類似物可以直接作用于上述骨組織細(xì)胞,調(diào)節(jié)其功能活性。因此,我們希望通過將ADSC, β-TCP以及calcitrol或其類似物結(jié)合起來,探索一種用于修復(fù)骨組織缺損的新型組織工程治療方案,并揭示其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕緦?shí)驗(yàn)的目的在于通過一系列體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn),來評價ADSC, β-TCP以及calcitrol結(jié)合修復(fù)骨缺損的效果,并深入探究活性維生素D及其類似物影響成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞功能活性的機(jī)制,最后,對比calcitrol及其類似物之一艾地骨化醇(eldecalcitol)在治療骨缺損效果上的差異,希望得到一種最佳的治療方案組合。實(shí)驗(yàn)方法：在第一階段研究中,我們提取大鼠皮下脂肪組織,分離獲得ADSC并于體外進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%接觸后,將ADSC與預(yù)制備的β-TCP滅菌顆粒共同培養(yǎng)并將培養(yǎng)基更換為成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。共培養(yǎng)21天后,制備大鼠股骨缺損模型,并使用附有ADSC的β-TCP顆粒進(jìn)行修復(fù)。術(shù)后經(jīng)腹腔注射給予calcitrol (125ng/Kg,1次/2天),于治療第7天、14天及28天取股骨標(biāo)本,進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析,評價骨修復(fù)效果。在實(shí)驗(yàn)第二階段,我們對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo),并向培養(yǎng)基中分別加入calcitrol (10-8M)及 eldecalcitol (10-8M),刺激7天及14天后提取總蛋白,通過western blot檢測調(diào)控成骨細(xì)胞功能的Runx2,以及調(diào)控破骨細(xì)胞分化的核因子kB配體受體激活劑(RANKL)及骨保護(hù)素(OPG)等蛋白,以期揭示活性維生素D及其類似物調(diào)控骨形成及骨吸收的機(jī)制。在第三階段實(shí)驗(yàn)中,我們同樣制備大鼠股骨缺損模型,在不進(jìn)行支架材料植入的情況下,經(jīng)口投給calcitrol (50ng/kg,1次/2天)及eldecalcitol (50ng/kg,1次/2天)治療,分別于28天及56天時,通過組織形態(tài)學(xué)手段,對比calcitrol及eldecalcitol在骨缺損修復(fù)中的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一階段實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ADSC, β-TCP及calcitrol聯(lián)合用于骨缺損修復(fù)時,可以明顯增加新骨形成的量,同時,由于ADSC的存在,在新骨形成區(qū)域,檢測到高水平表達(dá)的ALP和Runx2。Calcitrol在骨缺損修復(fù)早期,表現(xiàn)出對破骨細(xì)胞強(qiáng)烈的抑制作用,在減少破骨細(xì)胞數(shù)量的同時,也抑制了組織蛋白酶K(CK)的表達(dá)。第二階段實(shí)驗(yàn)證實(shí),在體外培養(yǎng)體系中加入calcitrol及eldecalcitol均可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞Runx2及OPG的表達(dá),并抑制RANKL的表達(dá)。而calcitrol對MC3T3-E1的這種調(diào)控作用略強(qiáng)于eldecalcitolo第三階段實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在分別應(yīng)用calcitrol (CAL組)和eldecalcitol (ELD組)治療骨缺損28天后,CAL組新骨形成量略高于ELD組,且兩實(shí)驗(yàn)組均明顯高于對照組。治療56天后,CAL組和ELD組在新骨骨量上已沒有明顯差異,但ELD組新骨基質(zhì)中未礦化膠原面積略大于CAL組。CK染色顯示,28天時,calcitrol即表現(xiàn)出對CK陽性破骨細(xì)胞較強(qiáng)的抑制作用,而在ELD組,這種對破骨細(xì)胞的抑制作用在56天時才開始顯現(xiàn)。結(jié)論：1. ADSC經(jīng)成骨分化誘導(dǎo),并以β-TCP為載體植入骨缺損后,可以大量表達(dá)ALP,并在缺損修復(fù)早期表達(dá)高水平的Runx2。2.活性維生素D體內(nèi)投給可明顯減少破骨細(xì)胞的數(shù)量,并且抑制CK的表達(dá)。3.Calcitrol及eldecalcitol可直接作用于成骨細(xì)胞,促進(jìn)Runx2及OPG的表達(dá),促進(jìn)成骨,并可抑制成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL,從而間接抑制破骨細(xì)胞分化。4.與eldecalcitol相比,calcitrol可以更快的促進(jìn)骨缺損區(qū)新骨的形成及礦化,且對破骨細(xì)胞功能的抑制作用較eldecalcitol出現(xiàn)的早。因此,我們認(rèn)為,將ADSC,β-TCP與calcitrol結(jié)合,應(yīng)用于骨缺損修復(fù)將是一個有效可行的組織工程治療方案。
【關(guān)鍵詞】：脂肪間質(zhì)干細(xì)胞 β磷酸三鈣 活性維生素D 骨缺損修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 符號說明14-15
• 第一部分15-43
• 1. 簡介15-18
• 2. 材料和方法18-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動物18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器18-19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)藥品19-20
• 2.4 實(shí)驗(yàn)試劑配制20-23
• 2.5 實(shí)驗(yàn)方法23-27
• 2.5.1 脂肪間質(zhì)干細(xì)胞的分離23-24
• 2.5.2 脂肪間質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化誘導(dǎo)并與β磷酸三鈣共培養(yǎng)24
• 2.5.3 應(yīng)用β-TCP-ADSC修復(fù)股骨缺損及活性維生素D投給24-26
• 2.5.4 免疫組織化學(xué)檢測ALP、Runx2和CK的表達(dá)以及TRAP染色26
• 2.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26-27
• 3. 結(jié)果27-35
• 3.1 ADSC成骨分化誘導(dǎo)27
• 3.2 新骨形成量評估27-29
• 3.3 ALP及Runx2免疫組化染色29-32
• 3.4 TRAP染色及CK免疫組化檢測32-35
• 4. 討論35-36
• 5. 結(jié)論36-38
• 參考文獻(xiàn)38-43
• 第二部分43-65
• 1. 簡介43-44
• 2. 材料和方法44-53
• 2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞44
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器44-45
• 2.3 實(shí)驗(yàn)藥品45-46
• 2.4 實(shí)驗(yàn)試劑配制46-51
• 2.5 實(shí)驗(yàn)方法51-53
• 2.5.1 MC3T3-E1細(xì)胞體外培養(yǎng)及成骨分化誘導(dǎo)51
• 2.5.2 Western blot檢測Runx2,OPG以及RANKL的表達(dá)51-53
• 2.5.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析53
• 3. 結(jié)果53-56
• 4. 討論56-58
• 5. 結(jié)論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 第三部分65-82
• 1. 簡介65-66
• 2. 材料和方法66-72
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動物66
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器66-67
• 2.3 實(shí)驗(yàn)藥品67-68
• 2.4 實(shí)驗(yàn)試劑配制68-71
• 2.5 實(shí)驗(yàn)方法71-72
• 2.5.1 大鼠股骨缺損的制備71-72
• 2.5.2 骨基質(zhì)膠原礦化程度評價72
• 2.5.3 破骨細(xì)胞定位及功能評價72
• 2.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析72
• 3. 結(jié)果72-77
• 3.1 新骨骨量及礦化度評估72-76
• 3.2 破骨細(xì)胞功能狀態(tài)評價76-77
• 4. 討論77-79
• 5. 結(jié)論79-80
• 參考文獻(xiàn)80-82
• 全文結(jié)論82-83
• 致謝83-84
• 博士期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文84-85
• 附錄85-138
• 附件138

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