本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-23b調(diào)節(jié)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)及在膿毒癥患者外周血白細(xì)胞的表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：膿毒癥是患者異常生理變化表現(xiàn)綜合征。膿毒癥的最大挑戰(zhàn)之一的是對其發(fā)生發(fā)展的潛在病理生理機(jī)制的更詳細(xì)的了解。大量的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞活化和膿毒癥間的聯(lián)系,而且日益顯現(xiàn)出,內(nèi)皮細(xì)胞在膿毒癥起著關(guān)鍵作用。膿毒癥中內(nèi)皮細(xì)胞激活的變化包括凝血功能、白細(xì)胞趨化粘附、血管通透性的變化,與炎癥發(fā)生發(fā)展以及和微循環(huán)障礙息息相關(guān)。盡管這些變化是宿主對感染的正常反應(yīng)的一部分,但在膿毒癥中它們可能過度表達(dá)從而成為膿毒癥異常的表型的標(biāo)志。相關(guān)研究表明,循環(huán)內(nèi)皮生物標(biāo)志物的水平增加證明人類膿毒癥與內(nèi)皮細(xì)胞的活化相關(guān)。這些生物標(biāo)記物和膿毒癥病情的嚴(yán)重程度和器官功能障礙之間的存在關(guān)聯(lián)�；趦�(nèi)皮細(xì)胞在膿毒癥病理生理學(xué)中的核心作用,這些發(fā)現(xiàn)不僅可以提高我們在膿毒癥病理生理過程中的內(nèi)皮細(xì)胞部分的理解,但也可能會提示建議相應(yīng)目標(biāo)診斷指標(biāo)和特定的治療性干預(yù)的可能。新近的mi RNA-23b給我們提供了觀察膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞變化發(fā)生和發(fā)展的新途徑。本文包括兩部分:第一部分micro RNA-23b調(diào)節(jié)膿毒癥臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)Mir-23b是新近發(fā)現(xiàn)的mi R,可以調(diào)節(jié)多種的信號通路,在細(xì)胞的增殖、細(xì)胞的分化、細(xì)胞的凋亡、以及細(xì)胞黏附等方面均能發(fā)揮作用,并在數(shù)種腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá),被認(rèn)為是類似于癌基因或抑癌基因從而發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道,mir-23b防止多種自身免疫性疾病通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的途徑,它調(diào)節(jié)炎癥因子如NF-κB,TNF-α,IL-1β和IL-17。因此,我們推測膿毒癥中mir-23b可能通過NF-κB通路和IL-17,從而調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化。在這項(xiàng)研究中,通過細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),然后轉(zhuǎn)染mir-23b的模仿劑或者抑制劑進(jìn)入細(xì)胞,并觀察轉(zhuǎn)染對mir-23b表達(dá)的上調(diào)和抑制作用,對膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的炎癥調(diào)節(jié)因子的影響。進(jìn)而探討mir-23b作為膿毒癥的靶點(diǎn)以及生物標(biāo)志物的可能性。方法:mir-23b抑制劑和模擬劑分別被轉(zhuǎn)染到人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)從而分別抑制和上調(diào)mir-23b表達(dá)。抑制劑和模擬劑的陰性對照(NC)同樣進(jìn)行轉(zhuǎn)染以便對照。觀察LPS刺激后4h和8h后各組細(xì)胞NF-κB、TNF-α、IL-6、E選擇素、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達(dá)和m RNA的表達(dá),以及mi R-23b表達(dá)的熒光圖片,進(jìn)行分析和比較。組間行χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn),SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P0.05為有顯著差異。結(jié)果:1轉(zhuǎn)染mir-23b抑制劑抑制了人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞中的mir-23b的表達(dá);轉(zhuǎn)染模擬劑則可促進(jìn)mir-23b的表達(dá)使用熒光顯微鏡可見人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞中,mir-23b發(fā)出綠色熒光。而定量PCR的結(jié)果則表明,mir-23b抑制劑的轉(zhuǎn)染組與空白對照組及NC組相比較,其mir-23b的表達(dá)可見顯著的降低,表明mir-23b抑制劑的轉(zhuǎn)染抑制mir-23b的表達(dá)有效。與此相反,mir-23b模擬劑的轉(zhuǎn)染組與空白組和NC組的模擬劑組相比,則發(fā)現(xiàn)mir-23b的表達(dá)增高,表明mir-23b模擬劑的轉(zhuǎn)染可促進(jìn)mir-23b表達(dá)。2 LPS下調(diào)人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞中mir-23b的表達(dá)LPS刺激的人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞模擬膿毒癥中血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果顯示,相比沒有用LPS刺激細(xì)胞表達(dá)的mi R-23b,轉(zhuǎn)染顯著模擬劑對照和拮抗劑對照的細(xì)胞LPS刺激4h或8h后的mi R-23b表達(dá)明顯下降(P0.01)。結(jié)果表明,在LPS刺激導(dǎo)致人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞的mir-23b表達(dá)減少,在膿毒癥中血管內(nèi)皮細(xì)胞活化伴有mir-23b表達(dá)的抑制。相反,在模擬劑轉(zhuǎn)染組與沒有LPS刺激的細(xì)胞相比較,LPS刺激后4h、8h檢測發(fā)現(xiàn),mir-23b表達(dá)輕微下降,但仍處于高水平。在抑制劑的轉(zhuǎn)染組中,LPS刺激后內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的mir-23b則仍然很低。3 LPS促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響LPS刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)后4h、8h檢測發(fā)現(xiàn),炎性因子NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,VCAM-1和E-選擇素E均顯著增加(P0.05),表明LPS刺激的人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子,進(jìn)而導(dǎo)致膿毒癥中的炎癥反應(yīng)。4 mir-23b模擬劑抑制LPS刺激后炎癥因子的表達(dá)LPS刺激人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞4h、8h在轉(zhuǎn)染模擬NC組的NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,VCAM-1和E-選擇素m RNA表達(dá)明顯增加(P0.05),與轉(zhuǎn)染模擬劑組有明顯差異(P0.05)。Western blot分析結(jié)果表明,LPS刺激后4h檢測發(fā)現(xiàn),模擬劑轉(zhuǎn)染組的NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1和E-選擇素的蛋白水平,明顯低于模擬劑NC組4h(P0.05)。LPS刺激后8h檢測發(fā)現(xiàn),VCAM-1的蛋白水平在模擬劑的轉(zhuǎn)染組顯著的低于模仿劑NC的轉(zhuǎn)染組(P0.05)。5 mir-23b抑制劑的轉(zhuǎn)染對LPS刺激以后細(xì)胞的炎癥因子的表達(dá)產(chǎn)生影響抑制劑NC轉(zhuǎn)染組LPS刺激4h、8h后檢測發(fā)現(xiàn),其NF-κB,IL-6,ICAM-1,VCAM-1和選擇素E的表達(dá),比其刺激以前的水平有顯著的增加(P0.05)。這些炎性因子的表達(dá)水平在抑制劑轉(zhuǎn)染組LPS刺激后與刺激前比較,也明顯升高(P0.05)。此外,抑制劑轉(zhuǎn)染組與抑制劑NC轉(zhuǎn)染組比較,LPS刺激后4h、8h后炎性因子水平顯著升高。Western blot分析表明,與抑制劑NC轉(zhuǎn)染組比較,LPS刺激后4h、8h抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,E選擇素和VCAM-1蛋白表達(dá)水平顯著增加(P0.05)。結(jié)論:LPS刺激后內(nèi)皮細(xì)胞的mi R-23b表達(dá)下降,而轉(zhuǎn)染mi R-23b模擬劑后,LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后NF-κB,IL-6,ICAM-1,VCAM-1,選擇素E的表達(dá)下降,而轉(zhuǎn)染mi R-23b抑制劑后,LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1、選擇素E的表達(dá)上調(diào)。以往研究表明,這些炎性因子均是膿毒癥炎癥網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(inflammatory network)的重要組成因子,在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。因而我們認(rèn)為,mi R-23b可以通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-6、E選擇素、ICAM-1、VCAM-1的釋放,進(jìn)而對膿毒癥進(jìn)行調(diào)節(jié)。第二部分micro RNA-23b在膿毒癥患者外周血的表達(dá)收集樣本外周血取自20例膿毒癥患者、10例SIRS患者及10例正常對照組人群,記錄相關(guān)的臨床資料,并采用mir Vana PARIS Kit方法進(jìn)行樣本外周血的血清中RNA抽提,然后使用Allin One的mi RNA q RT-PCR法對mi RNA-23b在血清中的相對定量進(jìn)行檢測,同時(shí)測定血中WBC計(jì)數(shù)、血清TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的變化,并結(jié)合患者的臨床資料測定SOFA評分,比較膿毒癥、SIRS及正常對照組血清中mi RNA-23b表達(dá)的差異,分析血清mi RNA-23b的表達(dá)與膿毒癥患者SOFA評分、WBC計(jì)數(shù)、血清TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的關(guān)系,并分析膿毒癥死亡組與存活組之間的差異,從而判定其與臨床指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果1、mi R-23b的檢測靈敏度以及線性范圍mi R-23b和U6檢測的最低檢出界限為6.97 pg/μL RNA,在6.97~6.97×104pg/μL的RNA范圍內(nèi)mi R-23b和U6測定的Ct值與RNA濃度之間存在良好的線性相關(guān)關(guān)系(r0.999)。2、外周血中mi R-23b的溫度穩(wěn)定性在4℃保存外周血循環(huán)血,1、3及5 d后,其總定量RNA從51.32 ng/μL下降至18.3 ng/μL,由此可見總RNA的降解隨保存時(shí)間的延長同步增多。而外周循環(huán)血的白細(xì)胞中mi R-23b和U6的表達(dá)水平則沒有明顯變化。3、膿毒癥患者病情分析20例膿毒癥患者中病情分布為:心內(nèi)膜炎患者2例,膽道感染患者2例,腹膜炎患者4例,肺部感染患者12例。28 d病死率為20%(4/20);SOFA評分2~11分,平均(5.8±2.52)分。4、外周血中mi R-23b、WBC、血清中TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α的比值變化與對照組相比較,膿毒癥組對象的mi R-23b表達(dá)顯著降低(P0.01),同時(shí)其血液中的WBC、IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值均顯著升高(P0.01);而膿毒癥組與SIRS組之間比較,各項(xiàng)指標(biāo)均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5、預(yù)后不同,膿毒癥病患組內(nèi)mi R-23b、血清中IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值之間的差異膿毒癥患者組中死亡患者與存活患者相比較,mi R-23b表達(dá)量明顯降低(P=0.003,P0.01),而血清中IL-10的水平則明顯升高(P=0.037,P0.01)。兩組患者的組間白細(xì)胞數(shù)(P=0.584),血清中TNF-α水平(P=0.324)以及IL-10和TNF-α的比值(P=0.263)均沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。6、膿毒癥患者的mi R-23b水平與其自身的WBC、血清中TNF-α、IL-10的水平以及SOFA評分之間的關(guān)系膿毒癥患者外周血mi R-23b表達(dá)所需的循環(huán)數(shù)與其自身的SOFA評分、血清中的TNF-α和IL-10呈顯著相關(guān)(其r值分別為0.473、0.485和0.470,P0.05);其與WBC計(jì)數(shù)(r值分別為0.301)以及IL-10和TNF-α的比值均無明顯相關(guān)(r值為0.039,P0.05)。7、IL-10、TNF-α在膿毒癥組病患的表達(dá)水平及兩者的比值和SOFA評分之間的關(guān)系膿毒癥患者的SOFA評分與血清中的IL-10(r值為0.369)、TNF-α(r值為0.410)和IL-10與TNF-α的比值(r值分別為0.124)均無明顯的相關(guān)性(P0.05)。限制此研究有許多限制。首先,我們沒有使用一個(gè)連續(xù)的患者人群因此這項(xiàng)研究可能會受到選擇偏倚。其次,我們只分析了從最初循環(huán)血的相關(guān)指標(biāo),而并沒有隨著時(shí)間的推移動態(tài)觀察相應(yīng)生物標(biāo)志物的變化。第三,有可能有未測量的干擾因素或混雜。第四,部分納入膿毒癥或SIRS組患者可能有其他疾病的原因,可能是誤診,而最終對其結(jié)果形成了干擾。最后,我們的樣本規(guī)模太小。更大規(guī)模的研究可能提供更完整的分析。結(jié)論:mi RNA-23b的表達(dá)水平在膿毒癥組患者較正常對照組明顯下降,但與SIRS組患者相比較則無明顯差異。mi RNA-23b的表達(dá)水平反應(yīng)了機(jī)體的免疫水平,可能作為膿毒癥的嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后的生物學(xué)分子標(biāo)志物,而其能否能在膿毒癥的臨床輔助診斷以及預(yù)后判斷中進(jìn)行應(yīng)用,則需要大樣本量臨床研究對其進(jìn)一步判斷,mi RNA-23b在膿毒癥發(fā)生和發(fā)展中的相關(guān)作用以及機(jī)制,任然有待對其進(jìn)行深入的研究。
【關(guān)鍵詞】：膿毒癥 mi RNA-23b 外周血 分子標(biāo)志物
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 英文摘要7-13
• 中文摘要13-18
• 第一章 前言18-20
• 第二章Micro RNA-23b調(diào)節(jié)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)20-35
• 2.1 材料和方法21-28
• 2.2 結(jié)果28-31
• 2.3 討論31-35
• 第三章micro RNA-23b在膿毒癥病人的外周血的白細(xì)胞中的表達(dá)及意義35-53
• 3.1 對象、材料與方法36-44
• 3.2 結(jié)果44-47
• 3.3 討論47-53
• 全文總結(jié)53-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 文獻(xiàn)綜述一63-84
• 參考文獻(xiàn)73-84
• 文獻(xiàn)綜述二84-105
• 參考文獻(xiàn)98-105
• 博士研究生期間發(fā)表的論文105-106
• 致謝106

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 周紅;劉鑫;鄭江;;膿毒癥治療——挑戰(zhàn)與機(jī)遇并存[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年02期

2 曾小莉;張韶巖;張京嵐;李鳳梅;馬雪蓮;米玉紅;;微小RNA-150在膿毒癥患者外周血白細(xì)胞的表達(dá)及其臨床意義[J];中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2011年04期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馮菲菲;外周血microRNA-23b作為胃癌篩查分子標(biāo)志物的價(jià)值和應(yīng)用研究[D];浙江大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-23b調(diào)節(jié)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)及在膿毒癥患者外周血白細(xì)胞的表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：305360