本文關鍵詞：膀胱癌特異性溶瘤腺病毒與順鉑或吉西他濱聯合抗膀胱腫瘤的體外實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,目前臨床多采用以手術治療為主,輔以化療、放療和膀胱灌注等方法的綜合治療,但其治愈率遠未令人滿意。隨著分子生物學、病毒學研究的進展,腫瘤的病毒基因療法成為近年來非常熱門的一種腫瘤生物治療的方法。有研究報道將化療和病毒基因治療相結合殺傷腫瘤細胞具有很好的療效,為提高腫瘤的治療效果開辟了新的途徑。本課題組成功構建了膀胱癌特異性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A,該腺病毒在膀胱特異性啟動子UPII的控制下能選擇性地在膀胱癌細胞中復制進而發(fā)揮溶瘤效應,對正常細胞沒有影響。順鉑和吉西他濱是臨床治療膀胱癌的常用化療藥物,其作用機制與溶瘤腺病毒不同。本實驗將Ad/PSCAE/UPII/E1A與化療藥物聯合,旨在研究兩者聯用是否能發(fā)揮協同抗膀胱腫瘤的作用,并初步探討兩者聯用的可能的機制,為膀胱癌的治療提供一種新的治療策略,并為將來的臨床應用提供基礎的理論和實驗依據。方法：利用膀胱組織特異性啟動子UPII控制溶瘤腺病毒E1A基因的表達,并在UPII啟動子上游插入前列腺干細胞抗原增強子(PSCAE)以增強UPII啟動子的活性,構建出膀胱癌特異性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A;以螢火蟲熒光素酶(Luc)報告基因置換Ad/PSCAE/UPII/E1A中的E1A基因,構建出重組腺病毒Ad/PSCAE/UPII/Luc.利用表達Luc基因的重組腺病毒Ad/PSCAE/UPII/Luc,體外感染膀胱癌細胞株EJ、5637、BIU87和T24,通過檢測細胞內Luc的活性觀察重組腺病毒對膀胱癌細胞的感染效率；采用Western blot法分析溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A感染膀胱癌細胞后細胞內E1A基因的表達情況；應用MTT比色法檢測Ad/PSCAE/UPII/E1A與化療藥(順鉑和吉西他濱)單用或聯用對人膀胱癌細胞增殖的影響,并通過聯合指數法對聯合作用進行分析；采用MTT比色法檢鋇與化療藥單用或聯用對人正常尿Ad/PSCAE/UPII/E1A路上皮細胞SV-HUC-1的細胞毒作用；利用流式細胞術觀察與化療藥單用或聯用對膀胱癌細胞周期及凋亡的影響；采用Ad/PSCAE/UPII/E1A法觀察qRT-PCR與化療藥單用或聯用對凋亡信號轉導通路相關因子Ad/PSCAE/UPII/E1A表達的影響；采用nRNA法分析Western blot與化療藥單用或聯用Ad/PSCAE/UPII/E1A對凋亡信號轉導通路相關因子蛋白表達的影響；采用Western blot法檢測GEM與Ad/PSCAE/UPII/E1A合用感染T24細胞后E1A基因在細胞中的表達以及GEM對T24細胞表面CAR表達的影響。結果：(1)重組腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A和Ad/PSCAE/UPII/Luc在HEK293細胞內擴增后,經氯化銫密度梯度離心法純化,獲得了純度較好且滴度較高的腺病毒；(2)Ad/PSCAE/UPII/Luc在體外能有效感染CAR高表達的膀胱癌細胞株EJ、5637和BIU87,隨著感染復數的增加,細胞內Luc活性相應增強,呈劑量依賴性；Ad/PSCAE/UPII/Luc感染CAR低表達的膀胱癌細胞株T24后,細胞內Luc活性很低,說明感染效率差；(3) Ad/PSCAE/UPII/E1A感染CAR高表達的膀胱癌細胞株EJ、5637和BIU87后,三種細胞株內E1A蛋白均呈高表達,說明感染效率高。而Ad/PSCAE/UPII/E1A感染CAR低表達的膀胱癌細胞株T24后,細胞內E1A蛋白的表達很低,說明感染效率差；(4)Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑分別單用均能抑制CAR高表達的膀胱癌細胞的生長,兩者聯用具有顯著的協同作用；(5)Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱分別單用均能抑制CAR高表達的膀胱癌細胞的生長,兩者聯用具有顯著的協同作用；(6)Ad/PSCAE/UPII/E1A單用不能抑制CAR低表達的T24細胞的生長,與順鉑聯用后無協同作用,但在與吉西他濱聯用后產生了顯著的協同作用；(7)Ad/PSCAE/UPII/E1A能將5637細胞周期阻滯于G1期,順鉑也能將5637細胞周期阻滯于G1期,兩者聯用對G1期的阻滯程度進一步加��；(8)Ad/PSCAE/UPII/E1A能將EJ細胞周期阻滯于G1期,吉西他濱能將EJ細胞周期阻滯于S期,兩者聯用對S期的阻滯程度顯著增加；(9)Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑分別單用均能誘導5637細胞發(fā)生凋亡,兩者聯用后凋亡更加顯著；(10)Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱分別單用均能誘導EJ細胞發(fā)生凋亡,兩者聯用后凋亡更加顯著；(11)Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯用可在轉錄水平增加Fas及Bax的表達、降低Bcl-2的表達；在蛋白水平上調Fas、Bax、Bak、活化形式的Bid、caspase 8、9、3及PARP的表達,下調Bcl-2和Bcl-XL的表達。說明兩者聯用可能通過增強外源性及內源性凋亡通路誘導5637細胞凋亡；(12)Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯用可在轉錄水平增加Bax的表達、降低Bcl-2的表達；在蛋白水平上調Bax、Bak、活化形式的caspase 9、3及PARP的表達,下調Bcl-2和Bcl-XL的表達。說明兩者聯用可能通過增強內源性凋亡通路誘導EJ細胞凋亡；(13)吉西他濱能提高Ad/PSCAE/UPII/Luc和Ad/PSCAE/UPII/E1A對T24細胞的感染效率；(14)吉西他濱能誘導T24細胞表面CAR的表達,繼而增強重組腺病毒對細胞的感染效率；(15) Ad/PSCAE/UPII/E1A聯合小劑量順鉑或吉西他濱對正常尿路上皮細胞的殺傷效應很小,無明顯相加毒性。結論：(1)Ad/PSCAE/UPII/E1A 和 Ad/PSCAE/UPII/Luc能在體外有效感染CAR高表達的膀胱癌細胞株EJ、5637和BIU87,具有較高的感染效率,而對CAR低表達的膀胱癌細胞株T24感染效率差；(2)Ad/PSCAE/UPII/E1A能顯著抑制CAR高表達的膀胱癌細胞的增殖,并呈劑量及時間依賴性,但對CAR低表達的T24細胞無抑制作用；(3)Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯用能協同殺傷CAR高表達的膀胱癌細胞,但對CAR低表達的膀胱癌細胞不產生協同殺傷作用；(4)Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯用能協同殺傷CAR高表達及低表達的膀胱癌細胞；(5) Ad/PSCAE/UPII/E1A能將膀胱癌細胞周期阻滯于G1期,與順鉑聯用后G1期阻滯程度加重,而與吉西他濱聯用后將細胞周期阻滯于S期；(6)Ad/PSCAE/UPII/E1A能誘導膀胱癌細胞凋亡,與順鉑或吉西他濱聯用后促凋亡作用進一步增強；(7) Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯用后可能通過增強外源性及內源性凋亡通路誘導膀胱癌細胞凋亡；(8) Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯用后可能通過增強內源性凋亡通路誘導膀胱癌細胞凋亡；(9)吉西他濱可能通過誘導T24細胞表面CAR的表達,增強Ad/PSCAE/UPII/E1A對CAR低表達的T24細胞的感染效率,繼而發(fā)揮協同殺傷T24細胞的作用；(10)Ad/PSCAE/UPII/E1A具有膀胱癌特異性復制能力,與小劑量順鉑或吉西他濱聯用對正常細胞無相加毒性。
【關鍵詞】：膀胱癌 溶瘤腺病毒 順鉑 吉西他濱 協同作用
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.14
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-13
• 前言13-31
• 1.1 膀胱腫瘤及治療現狀13-14
• 1.2 腫瘤基因治療14-20
• 1.3 膀胱癌特異性溶瘤腺病毒膀胱內灌注治療及聯合治療20-21
• 1.4 順鉑吉西他濱在膀胱癌治療中的應用21-22
• 1.5 前期工作、立題依據和本課題主要研究內容22-25
• 參考文獻25-31
• 第一部分 膀胱癌特異性溶瘤腺病毒的擴增、純化及感染效率的測定31-50
• 1.1 實驗材料31-34
• 1.1.1 主要材料和試劑31-32
• 1.1.2 主要溶液的配制32-33
• 1.1.3 主要儀器及設備33-34
• 1.2 實驗方法34-44
• 1.2.1 HEK293人胚腎細胞的復蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存34-36
• 1.2.2 溶瘤腺病毒的擴增與純化36-37
• 1.2.3 溶瘤腺病毒滴度的測定37-38
• 1.2.4 膀胱癌細胞的復蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存38-39
• 1.2.5 重組腺病毒對膀胱癌細胞感染效率的測定39-44
• 1.2.6 統(tǒng)計學方法44
• 1.3 結果44-46
• 1.3.1 擴增純化后重組腺病毒滴度測定結果44
• 1.3.2 重組腺病毒純度測定結果44-45
• 1.3.3 Ad/PSCAE/UPII/Luc對膀胱癌細胞感染效率的測定45
• 1.3.4 溶瘤腺病毒感染膀胱癌細胞后E1A基因在細胞中的表達45-46
• 1.4 討論46-48
• 1.5 結論48-49
• 參考文獻49-50
• 第二部分 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑或吉西他濱聯用對膀胱癌細胞生長的抑制作用50-78
• 2.1 實驗材料50-52
• 2.1.1 主要材料和試劑50
• 2.1.2 主要溶液的配制50-51
• 2.1.3 主要儀器及設備51-52
• 2.2 實驗方法52-56
• 2.2.1 膀胱癌細胞的復蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存52
• 2.2.2 MTT比色法檢測細胞活力52-54
• 2.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡54-55
• 2.2.4 流式細胞術檢測細胞周期分布55-56
• 2.2.5 統(tǒng)計學方法56
• 2.3 結果56-73
• 2.3.1 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑單用對人膀胱癌細胞生長的抑制作用56-58
• 2.3.2 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯用對人膀胱癌細胞生長的抑制作用58-60
• 2.3.3 Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱單用對人膀胱癌細胞生長的抑制作用60-62
• 2.3.4 Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯用對人膀胱癌細胞生長的抑制作用62-64
• 2.3.5 Ad/PSCAE/UPII/E1A、順鉑與吉西他濱分別單用對正常人尿路上皮細胞SV-HUC-1的影響64-65
• 2.3.6 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑或吉西他濱聯用對正常人尿路上皮細胞SV-HUC-1的影響65-67
• 2.3.7 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯用對人膀胱癌細胞凋亡的影響67-68
• 2.3.8 Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯用對人膀胱癌細胞凋亡的影響68-69
• 2.3.9 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯用對人膀胱癌細胞周期分布的影響69-71
• 2.3.10 Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯用對人膀胱癌細胞周期分布的影響71-73
• 2.4 討論73-76
• 2.5 結論76-77
• 參考文獻77-78
• 第三部分 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑或吉西他濱聯用發(fā)揮協同抗膀胱腫瘤作用的機制78-109
• 3.1 實驗材料78-81
• 3.1.1 主要材料和試劑78-79
• 3.1.2 主要儀器及設備79-80
• 3.1.3 主要溶液的配制80-81
• 3.2 實驗方法81-90
• 3.2.1 膀胱癌細胞的復蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存81
• 3.2.2 qRT-PCR法檢測凋亡相關基因mRNA水平的變化81-84
• 3.2.3 Western blot法檢測凋亡相關基因蛋白水平的變化84-88
• 3.2.4 吉西他濱對重組腺病毒感染CAR低表達的膀胱癌細胞的效率的影響88-89
• 3.2.5 Western blot法檢測吉西他濱對T24細胞CAR表達的影響89-90
• 3.2.6 統(tǒng)計學方法90
• 3.3 結果90-98
• 3.3.1 Ad/PSCAE/UPII/E1A與順鉑聯用對凋亡相關基因表達的影響90-92
• 3.3.2 Ad/PSCAE/UPII/E1A與吉西他濱聯用對凋亡相關基因表達的影響92-96
• 3.3.3 吉西他濱對重組腺病毒感染CAR低表達的膀胱癌細胞的效率的影響96-97
• 3.3.4 吉西他濱對T24細胞CAR表達的影響97-98
• 3.4 討論98-104
• 3.5 結論104-105
• 參考文獻105-109
• 中英文縮寫索引109-112
• 在學期間的研究成果112-113
• 致謝113

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前6條

1 王曉雷,千新來,趙清正,徐震綱,唐平章;E1A基因對頭頸部淋巴結轉移鱗癌細胞體外生長的抑制和化放療增敏的作用[J];癌癥;2003年11期

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3 張薇,項永兵,劉振偉,方茹蓉,阮志賢,孫璐,高立峰,金凡,高玉堂;1973-1999年上海市區(qū)老年人惡性腫瘤發(fā)病趨勢分析[J];中華老年醫(yī)學雜志;2005年09期

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  本文關鍵詞：膀胱癌特異性溶瘤腺病毒與順鉑或吉西他濱聯合抗膀胱腫瘤的體外實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：304665