本文關(guān)鍵詞：MALAT1在食管癌發(fā)生中的作用與機制研究及其與食管癌易感性的關(guān)聯(lián)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：食管癌是一種高致死性的惡性腫瘤,我國西南地區(qū)是食管癌的高發(fā)地區(qū)之一,其中以鱗狀細胞癌分布最廣,大約占患者總數(shù)的90%以上,預(yù)后極差。每年因食管癌死亡人數(shù)眾多,降低食管癌死亡率的一大原則在于早期診斷及治療,其重點在于發(fā)現(xiàn)食管癌的易感人群及進行早期干預(yù)。食管癌的發(fā)病風(fēng)險受到環(huán)境因素和遺傳因素的共同作用,目前的研究表明,某些特殊飲食及生活習(xí)慣的人群更易于罹患食管癌,例如喜食腌制食品、喜熱飲熱食、長期飲酒及大量吸煙者。近年來,隨著人們對基因組學(xué)的認識不斷深入,遺傳因素在食管癌發(fā)病機制中的地位逐漸被認識。人們發(fā)現(xiàn),攜帶某些特定基因變異的人群,患腫瘤的風(fēng)險性更高,這些變異往往出現(xiàn)在與物質(zhì)代謝及腫瘤惡性行為相關(guān)的基因位點。與腫瘤易感性相關(guān)的遺傳變異包括寡核苷酸多態(tài)性及基因組拷貝數(shù)變異。人們對于前者的認識已較為充分,而對后者的關(guān)注則相對較晚。由于拷貝數(shù)變異的研究方法所限,人們對于拷貝數(shù)變異與腫瘤易感性之間關(guān)系的認識還極為局限,對于其與食管癌的易感風(fēng)險之間的認識更是知之甚少。此外,前期的研究主要集中于具有蛋白編碼功能的基因序列的拷貝數(shù)變異,近年來的研究已經(jīng)表明,非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生中扮演著同樣重要的角色,出現(xiàn)于非編碼RNA位點的寡核苷酸的多態(tài)性同樣可以改變?nèi)巳夯寄[瘤的風(fēng)險,在本研究中,我們將對一些與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的m RNA及非編碼RNA基因位點的拷貝數(shù)變異是否與腫瘤易感風(fēng)向相關(guān)做出探討。這些位點均取自于食管癌組織中的高頻變異區(qū),如3q26,8q24及11q13。長鏈非編碼RNA是近年來腫瘤學(xué)研究的一大熱點,既往人們認為,基因組中大量不具備蛋白編碼功能的RNA序列在生命活動過程中并沒有任何意義,是進化過程中的垃圾序列。然而,近年來的研究越來越多的顯示,這些不具備編碼功能的RNA,在生命活動過程中同樣扮演著極為重要的角色。長鏈非編碼RNA是其中極為重要的一類非編碼RNA分子。長鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生過程中的作用尤為引人關(guān)注,在目前幾乎所有的人類惡性腫瘤中,均發(fā)現(xiàn)了長鏈非編碼RNA參與其中。目前已知的較為經(jīng)典的腫瘤相關(guān)長鏈非編碼RNA包括H19、HOTAIR、GAS5、MEG3、MALAT1等,既往的研究表明,這些長鏈非編碼RNA與多種腫瘤的發(fā)生與進展密切相關(guān),如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等。lnc RNA MALAT1是一種經(jīng)典的腫瘤相關(guān)非編碼RNA,其促癌作用已得到廣泛認可,但其在食管癌中的作用尚不明確。此外,MALAT1在不同組織中作用方式有別,其在食管癌中的作用與機制有待深入闡明。因此,本研究擬對MALAT1在食管癌中的功能做出初步的評估,在此基礎(chǔ)上,深入探討MALAT1在食管癌中的具體作用方式,全面、深入地解釋其在食管癌發(fā)生中的機制,為我們認識食管癌的發(fā)病及尋找治療策略提供新的證據(jù)。在認識MALAT1在食管癌發(fā)生過程中的作用與機制基礎(chǔ)上,本研究還試圖尋找調(diào)控MALAT1表達的表觀遺傳因素。前期的研究揭示了組蛋白修飾在MALAT1表達水平調(diào)控中發(fā)揮重要的作用,在本研究中,我們試圖探討表觀遺傳的另一類機制——啟動子區(qū)的Cp G島甲基化能否對MALAT1的表達起調(diào)控作用。我們的研究結(jié)果顯示:1、所挑取的MALAT1、PRKCI等四個腫瘤相關(guān)位點的拷貝數(shù)變異與食管癌的易感性均無明顯關(guān)聯(lián);2、MALAT1在食管癌組織中呈明顯的拷貝數(shù)擴增,且擴增與其在食管癌組織中的過表達相關(guān);MALAT1主要在晚期食管癌組織中呈現(xiàn)過表達趨勢,在早期食管癌中過表達不明顯。表明MALAT1主要促進食管癌的深層進展而不是其腫瘤發(fā)生;3、MALAT1的表達干擾抑制了食管癌的增殖,轉(zhuǎn)移功能,并導(dǎo)致了G2/M期阻滯,以及凋亡比例增加;我們的研究結(jié)果還顯示,MALAT1的干擾可通過磷酸化激活A(yù)TM-CHK2通路,該通路的激活與G2/M阻滯有關(guān);在腫瘤組織中,MALAT1的表達水平與ATM-CHK2通路的磷酸化水平呈負關(guān)聯(lián),說明MALAT1的過表達可能通過對ATM-CHK2通路去磷酸化修飾,抑制ATM-CHK2通路的激活,使其對DNA損傷的敏感性降低,解除DNA損傷引起的周期阻滯,從而促進食管癌的快速生長;4、Cp G島甲基化水平對MALAT1的表達水平并無明顯影響。本文的主要研究內(nèi)容如下:1、MALAT1、PRKCI等腫瘤相關(guān)基因的拷貝數(shù)變異與食管癌易感性的關(guān)聯(lián)分析我們首先對食管癌組織中常見的染色體變異區(qū)進行了文獻回顧分析,發(fā)現(xiàn)3q26,8q24,11q13等區(qū)域在食管癌組織中的擴增趨勢十分明顯,基于生殖系(血液標本)與實體細胞(組織細胞)中遺傳變異可能存在關(guān)聯(lián)這一假說,我們將候選CNV確定在這幾個區(qū)域之內(nèi)。聯(lián)合生物信息學(xué)及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸蜻x位點進行了系統(tǒng)性的評價,最終確定了位于腫瘤相關(guān)基因PRKCI基因座的Variation_59109,長鏈非編碼RNA MALAT1基因座的Variation_65973等共計四個CNV位點作為研究靶點。我們利用一種新開發(fā)的CNV分型技術(shù)—Accucopy方法對所挑取的CNV位點在生殖系細胞(血液標本)中進行了拷貝數(shù)分型,研究對象包括201個食管鱗癌患者及193個健康對照。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示,血液標本中這四個位點的拷貝數(shù)變異與食管癌的易感性之間并無明顯關(guān)聯(lián)。2、lnc RNA MALAT1在食管癌組織中的拷貝數(shù)擴增促進其過表達,且其表達水平與食管癌的臨床病理特征相關(guān)聯(lián)利用Accucopy技術(shù),我們對食管癌組織中MALAT1的拷貝數(shù)也進行了檢測,在54例食管癌組織中,我們發(fā)現(xiàn)了其中12例組織中出現(xiàn)MALAT1基因的拷貝數(shù)擴增。采用q RT-PCR的方法,我們定量檢測了MALAT1在這54對食管癌組織及對應(yīng)的正常食管組織中的表達水平,以及在食管癌細胞株及正常食管上皮細胞株中的表達水平,并對MALAT1的表達水平與腫瘤大小、有無轉(zhuǎn)移等臨床病理特征進行關(guān)聯(lián)分析,初步推測MALAT1在食管癌發(fā)生過程中所起的作用。結(jié)果顯示,MALAT1在食管癌組織中的拷貝數(shù)擴增與其在食管癌中的過表達相關(guān)聯(lián),且MALAT1的過表達與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。3、細胞水平研究表明MALAT1的過表達促進食管癌的生長、遷移與侵襲,其促生長作用與其對ATM-CHK2通路的調(diào)控有關(guān)通過si RNA干擾技術(shù)沉默MALAT1在食管癌細胞株EC109、EC9706、KYSE150及KYSE450中的表達水平,并通過CCK8法、平板克隆形成實驗、裸鼠原位成瘤實驗、transwell細胞遷移侵襲實驗檢測MALAT1表達干擾后對食管癌細胞株的生長、克隆形成、遷移、侵襲等腫瘤細胞學(xué)行為的影響。通過流式細胞技術(shù)檢測MALAT1干擾對食管癌細胞株的細胞周期、細胞凋亡的影響,推測其調(diào)控食管癌細胞生長的機制。本部分結(jié)果顯示,對MALAT1進行表達干擾后,食管癌細胞株的生長、遷移、侵襲行為受到抑制,且食管癌細胞株的G2/M期細胞比例增加,凋亡細胞比例也增加。前期報道表明了MALAT1在細胞周期及基因組穩(wěn)定性維持中的作用,基因組的穩(wěn)定性與細胞周期進展相關(guān),因此,我們推測MALAT1可能參與到DNA損傷應(yīng)答通路的調(diào)控。我們利用western-blotting法檢測了MALAT1干擾前后,ATM-CHK2通路的表達水平及磷酸化水平的改變,該通路的磷酸化激活與細胞周期組織相關(guān)。結(jié)果顯示,MALAT1表達干擾后,ATM-CHK2通路的磷酸化水平顯著增高,提示MALAT1的過表達與ATM-CHK2的去磷酸化失活相關(guān),MALAT1可通過對ATM-CHK2通路的調(diào)控促進食管癌生長。4、MALAT1的表達水平不受Cp G島甲基化的調(diào)控既往的研究表明MALAT1的表達水平受到組蛋白甲基化、mi RNA及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,表觀遺傳學(xué)機制在MALAT1的表達調(diào)控中的意義尚未得到充分揭示。在本研究中,我們首先采用BSP法對MALAT1啟動子區(qū)的Cp G島進行了測序,分析其啟動子區(qū)的DNA甲基化與MALAT1表達水平之間的關(guān)系;此外,我們在細胞水平同樣證明了MALAT1的表達水平并不受DNA去甲基化酶5-aza-CDR的控制。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗癌 拷貝數(shù)變異 長鏈非編碼RNA MALAT1 周期阻滯
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表5-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-16
• 第一章 前言16-19
• 第二章 MALAT1等腫瘤相關(guān)基因的生殖系拷貝數(shù)變異與食管癌易感性的關(guān)聯(lián)分析19-39
• 2.1 材料與方法21-31
• 2.2 結(jié)果31-36
• 2.3 討論36-39
• 第三章 MALAT1的表達水平與食管癌組織中的拷貝數(shù)及臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)39-49
• 3.1 材料與方法39-45
• 3.2 結(jié)果45-47
• 3.3 討論47-49
• 第四章 長鏈非編碼RNA MALAT1在食管癌中的功能與機制研究49-65
• 4.1 長鏈非編碼RNA MALAT1在食管癌中的功能研究49-56
• 4.1.1 材料與方法49-52
• 4.1.2 結(jié)果52-55
• 4.1.3 討論55-56
• 4.2 長鏈非編碼RNA MALAT1的過表達促進食管鱗狀細胞癌生長的機制研究56-65
• 4.2.1 材料與方法56-60
• 4.2.2 結(jié)果60-63
• 4.2.3 討論63-65
• 第五章 CpG島甲基化水平與MALAT1表達水平之間的關(guān)聯(lián)研究65-72
• 5.1 材料與方法65-68
• 5.2 結(jié)果68-71
• 5.3 討論71-72
• 全文總結(jié)72-74
• 參考文獻74-83
• 文獻綜述一 基因拷貝數(shù)變異與人類疾病83-98
• 參考文獻92-98
• 文獻綜述二 長鏈非編碼RNA與腫瘤98-114
• 參考文獻108-114
• 攻讀博士學(xué)位期間的研究成果114-115
• 致謝115-117
• 附錄117

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 胡力文;MALAT1在食管癌發(fā)生中的作用與機制研究及其與食管癌易感性的關(guān)聯(lián)分析[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 劉平平;長鏈非編碼RNA MALAT1在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達及功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

  本文關(guān)鍵詞：MALAT1在食管癌發(fā)生中的作用與機制研究及其與食管癌易感性的關(guān)聯(lián)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：304113