發(fā)布時(shí)間：2017-04-13 13:12

  本文關(guān)鍵詞：粗糠柴霉素提高膀胱癌細(xì)胞對(duì)放療敏感性作用機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:研究粗糠柴霉素(Rottlerin)對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及其對(duì)膀胱腫瘤放射增敏的影響,并闡明其作用機(jī)制,為粗糠柴霉素聯(lián)合放療治療膀胱腫瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法:四甲基偶氮唑鹽實(shí)驗(yàn)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT)測(cè)定粗糠柴霉素對(duì)EJ細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng);實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)篩選有效自噬相關(guān)基因Atg12的siRN A;透射電鏡檢測(cè)粗糠柴霉素及不同劑量放射線照射后處理后自噬體的形成情況;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)粗糠柴霉素對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率影響;Western Blotting檢測(cè)粗糠柴霉素處理后自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá),以及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3,PARP表達(dá)的影響;同時(shí)用粗糠柴霉素和Atg12的siRNA和放射線聯(lián)合作用后通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)算存活分?jǐn)?shù),來(lái)判斷到底是促進(jìn)自噬還是抑制自噬能增加放療敏感性。Western Blotting檢測(cè)粗糠柴霉素和Atg12的siRNA聯(lián)合放療后自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá);流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)粗糠柴霉素聯(lián)合放射線治療后對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率影響;采用Western Blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3,PARP表達(dá)。結(jié)果:(1)經(jīng)不同濃度(0,0.5,1,2,4,8,16μM)粗糠柴霉素分別處理24小時(shí),48小時(shí)和72小時(shí),EJ細(xì)胞增殖活力降低,0.5,1μM的粗糠柴霉素幾乎對(duì)EJ細(xì)胞沒(méi)有作用,濃度增加到2μM以上時(shí)(4,6,8,16μM)細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組,粗糠柴霉素對(duì)EJ細(xì)胞的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。(2)EJ細(xì)胞經(jīng)2μM粗糠柴霉素處理48小時(shí)后,克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)粗糠柴霉素可以減少EJ細(xì)胞的克隆形成數(shù)。和對(duì)照組相比它可降低EJ細(xì)胞形成克隆的能力。(3)EJ細(xì)胞經(jīng)2μM粗糠柴霉素處理48小時(shí)后,Western Blotting檢測(cè)粗糠柴霉素處理后自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)增高,透射電鏡檢測(cè)自噬體形成增多。(4)EJ細(xì)胞經(jīng)過(guò)放射線不同劑量照射后,通過(guò)計(jì)算生存分?jǐn)?shù),粗糠柴霉素可以提高EJ細(xì)胞的放射敏感性,2Gy即可輕度增加放射敏感性,但從4Gy開始放射敏感性增加較明顯。siRNA與x-射線聯(lián)合作用顯示效果不是很明顯,但是也有輕度抑制輻射的細(xì)胞殺傷效果。(5)粗糠柴霉素處理EJ細(xì)胞受到2Gy、4Gy射線照射24小時(shí)后,和單純受到2Gy、4Gy射線照射的EJ細(xì)胞相比均發(fā)生G1期阻滯。而單純放射線照射和未照射的細(xì)胞相比,細(xì)胞周期的阻滯發(fā)生在G2期。(6)細(xì)胞受到2Gy、4Gy照射的凋亡率分別為5.55%、16.88%,說(shuō)明EJ細(xì)胞對(duì)于放射治療具有一定的抗性,但是粗糠柴霉素聯(lián)合x射線處理細(xì)胞后使細(xì)胞的凋亡率明顯增加,2Gy、4Gy照射的凋亡率分別達(dá)到65.5%、72.43%。(7)對(duì)照組和2μM粗糠柴霉素處理EJ細(xì)胞24小時(shí)后,細(xì)胞受到2Gy射線照射,照射完成后接著培養(yǎng)24小時(shí),Caspase-3、PARP和活化的Caspase-3、PARP在粗糠柴霉素處理前后并無(wú)明顯的變化。同樣在放射線照射前后也無(wú)明顯變化。結(jié)論:以上研究結(jié)果說(shuō)明,粗糠柴霉素具有抑制膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,和x-ray聯(lián)合應(yīng)用可提高膀胱腫瘤的放療效果。
【關(guān)鍵詞】：粗糠柴霉素 膀胱癌細(xì)胞 自噬 凋亡
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.14
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文縮略詞表7-11
• 前言11-32
• 1.1 膀胱癌概述11-14
• 1.1.1 膀胱癌的現(xiàn)狀11
• 1.1.2 膀胱癌的發(fā)病危險(xiǎn)因素11-12
• 1.1.3 膀胱癌的組織、病理學(xué)分級(jí)12-13
• 1.1.4 膀胱癌的治療13-14
• 1.2 自噬14-24
• 1.2.1 自噬的概念15
• 1.2.2 自噬形成的分子機(jī)制15-17
• 1.2.3 自噬形成的檢測(cè)方法17-18
• 1.2.4 自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制18-22
• 1.2.5 自噬在腫瘤中的作用22-23
• 1.2.6 自噬與腫瘤治療23-24
• 1.2.7 自噬與凋亡的關(guān)系24
• 1.3 細(xì)胞凋亡24-27
• 1.3.1 細(xì)胞凋亡的概述25
• 1.3.2 細(xì)胞凋亡的調(diào)控因素25-27
• 1.3.3 細(xì)胞凋亡與腫瘤的關(guān)系27
• 1.4 粗糠柴霉素27-28
• 1.4.1 粗糠柴霉素的概述27-28
• 1.4.2 粗糠柴霉素在抗腫瘤中的作用28
• 1.5 研究的目的和意義28-30
• 第一部分 技術(shù)路線圖30-31
• 第二部分 技術(shù)路線圖31-32
• 第一章 粗糠柴霉素誘導(dǎo)EJ細(xì)胞凋亡32-50
• 1.1 材料32-33
• 1.1.1 藥品和試劑32
• 1.1.2 儀器32-33
• 1.2 方法33-42
• 1.2.1 主要試劑配制33-34
• 1.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存34
• 1.2.3 MTT比色實(shí)驗(yàn)34-35
• 1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)35
• 1.2.5 透射電鏡檢測(cè)自噬發(fā)生35-36
• 1.2.6 Western Blotting36-40
• 1.2.7 AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)記檢測(cè)凋亡細(xì)胞40-41
• 1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期41-42
• 1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析42
• 1.3 結(jié)果42-47
• 1.3.1 粗糠柴霉素抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)42-43
• 1.3.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)43
• 1.3.3 粗糠柴霉素處理后EJ細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的形成43-45
• 1.3.4 細(xì)胞周期變化45-46
• 1.3.5 粗糠柴霉素增加EJ細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用46-47
• 1.3.6 Caspase-3 和PARP47
• 1.4 討論47-49
• 1.5 結(jié)論49-50
• 第二章 粗糠柴霉素增加EJ細(xì)胞放射治療敏感性50-72
• 2.1 材料50-51
• 2.1.1 藥品和試劑50
• 2.1.2 儀器50-51
• 2.2 方法51-57
• 2.2.1 主要試劑配制51-52
• 2.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存52
• 2.2.3 siRNA的轉(zhuǎn)染及其轉(zhuǎn)染效率測(cè)定52-53
• 2.2.4 有效siRN A的序列的篩選53-55
• 2.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)55-56
• 2.2.6 透射電鏡檢測(cè)自噬發(fā)生56
• 2.2.7 Western Blotting56
• 2.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡56
• 2.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期56-57
• 2.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析57
• 2.3 結(jié)果57-69
• 2.3.1 siRN A導(dǎo)入靶細(xì)胞的效率57
• 2.3.2 siRN A抑制EJ細(xì)胞Atg12基因mRNA的表達(dá)57-60
• 2.3.3 受輻射后細(xì)胞的自噬通路被激活60-61
• 2.3.4 使用自噬誘導(dǎo)劑和抑制劑可以影響EJ細(xì)胞的放射敏感性61-63
• 2.3.5 放射線處理前后EJ細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的變化63-64
• 2.3.6 細(xì)胞周期變化64-67
• 2.3.7 粗糠柴霉素增加EJ細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用67-69
• 2.3.8 Caspase-3 和PARP69
• 2.4 討論69-71
• 2.5 結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-80
• 在學(xué)期間的研究成果80-81
• 致謝81

  本文關(guān)鍵詞：粗糠柴霉素提高膀胱癌細(xì)胞對(duì)放療敏感性作用機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：303673