本文關(guān)鍵詞：β1整合素與Ⅰ型膠原相互作用對胎兒胰腺星狀細(xì)胞活性和增殖的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胰腺星狀細(xì)胞(Pancreatic stellate cells, PaSCs)是位于嚙齒類動物和人類胰腺腺泡細(xì)胞,導(dǎo)管細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍的星形細(xì)胞。它在調(diào)節(jié)胰腺腺泡細(xì)胞功能,細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)更新和維持組織結(jié)構(gòu)中起了重要作用。整合素受體能夠整合ECM信號,對于細(xì)胞的功能和生存有重要作用,并且參與胰腺內(nèi)分泌腺和外分泌腺的發(fā)育。但是整合素受體信號對人胎兒PaSCs的作用還尚未闡述。本研究探討β1整合素與Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ)相互作用對胎兒胰腺星狀細(xì)胞功能和增殖的影響及其相關(guān)的信號通路。第一部分人胎兒胰腺星狀細(xì)胞的分離和鑒定目的：明確胎兒胰腺PaSCs在胰腺組織內(nèi)的形態(tài)和分布,分離、培養(yǎng)并鑒定胎兒PaSCs。方法：(1)收集人類胎兒胰腺(8-21周胎齡),新鮮分離的胰腺組織立即處理用于電鏡和/或免疫組化,以及分離原代細(xì)胞。(2)制備半薄(500 nm)和超薄(60nm)胰腺切片,電鏡和相差顯微鏡觀察PaSCs的形態(tài)和位置。(3)免疫熒光雙標(biāo)染色(PaSC markers/insulin, PaSC markers/CK19)評價PaSCs在胰腺的分布。(4)組織外生培養(yǎng)法分離原代胎兒PaSCs。(5)相差顯微鏡觀察PaSCs的外生和形態(tài),免疫熒光染色和蛋白印跡實驗鑒定PaSCs特征性標(biāo)記物(aSMA, Desmin, Vimentin, GFAP), ECM (collagen Ⅰ, collagen Ⅳ, fibronectin和laminin)以及相關(guān)的生長因子(CTGF和TGFβ1)。結(jié)果：(1)電鏡和相差顯微鏡下觀察,PaSCs呈典型的條索狀或紡錘狀,細(xì)胞核位居中間,細(xì)胞有細(xì)長偽足。(2)電鏡和免疫熒光結(jié)果證實PaSCs分布于胎兒胰腺的導(dǎo)管細(xì)胞或胰島細(xì)胞團(tuán)周圍。(3)胎兒胰腺組織塊培養(yǎng)72小時內(nèi)有星狀細(xì)胞自胰腺組織塊外生出,細(xì)胞呈星形或不規(guī)則形,胞漿內(nèi)遍布繞核周分布的脂滴樣透明顆粒。隨著培養(yǎng)時間延長,外生細(xì)胞不斷遷移,細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增加。(4)免疫熒光染色和蛋白印跡實驗鑒定組織塊外生法分離得到的PaSCs,傳代后胞內(nèi)脂質(zhì)消失,表達(dá)星狀細(xì)胞標(biāo)記物(aSMA, Desmin, Vimentin, GFAP),并高表達(dá)ECM (collagen Ⅰ, collagen Ⅳ, fibronectin和laminin)以及相關(guān)的生長因子(CTGF和TGFβ1),但是不表達(dá)導(dǎo)管細(xì)胞表面標(biāo)記物(CK19)和間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物(stromal cell surface marker)。結(jié)論：本課題首次證實PaSCs呈典型的條索狀或紡錘狀分布于胎兒胰腺的導(dǎo)管細(xì)胞或胰島細(xì)胞團(tuán)周圍。有效分離、純化胎兒PaSCs,細(xì)胞表達(dá)星狀細(xì)胞標(biāo)記物,合成ECM以及相關(guān)的生長因子。本實驗原代細(xì)胞的分離方法提供了足夠的細(xì)胞數(shù)量來分析整合素受體對PaSCs的功能及活性的影響,還為深入了解PaSCs在胰腺發(fā)育過程中對胰腺形態(tài)完整,血管新生,及內(nèi)分泌分化的作用提供了機(jī)會。第二部分 αβ1整合素在胎兒胰腺星狀細(xì)胞的表達(dá)和功能目的：分析整合素受體在胎兒PaSCs的表達(dá)情況。觀察α3β1整合素受體與相關(guān)配體相互作用對PaSCs粘附和遷移力的影響。探尋α3β1整合素受體與collagen Ⅰ相互作用對細(xì)胞生長因子的合成和增殖能力的影響及其相關(guān)的信號通路。方法：(1)免疫熒光染色和蛋白印跡實驗檢測β1和β3整合素受體及其相關(guān)的α亞基,包括α1,α2,α3,α5,α6,αv在人類胎兒PaSCs中的表達(dá)情況。(2)通過細(xì)胞粘附實驗和創(chuàng)傷劃痕實驗觀察PaSCs培養(yǎng)在collagen Ⅰ, collagen Ⅳ, fibronectin, laminin或BSA對照組上,細(xì)胞粘附力和遷移力的影響。(3) PaSCs在collagen Ⅰ或BSA對照組預(yù)處理的24孔板上培養(yǎng)24小時,通過Ki67免疫熒光染色檢測細(xì)胞的增殖能力,蛋白印跡實驗檢測PaSCs合成生長因子(TGFβ1和CTGF)的能力。(4)蛋白印跡實驗檢測α3和β1整合素受體的表達(dá)及下游信號分子(FAK, ERK, AKT, cyclinD1)的活性。結(jié)果：(1)免疫熒光染色和蛋白印跡實驗證實PaSCs表達(dá)β1整合素受體及其相關(guān)的α1-3,α5-6和αv亞基,其中,α3,α5和β1整合素受體高表達(dá),而β3表達(dá)水平相對較低。(2)細(xì)胞粘附實驗和創(chuàng)傷劃痕實驗結(jié)果表明,與對照組相比,PaSCs在collagen Ⅰ和collagen Ⅳ上培養(yǎng)表現(xiàn)出強(qiáng)粘附性[(3.568±0.5677)(2.957±0.5541)vs.(1.000±0.03604),p0.01-0.001]和強(qiáng)遷移力。(3)PaSCs在collagen Ⅰ上培養(yǎng)24小時,細(xì)胞增殖[(12.44±3.028)vs.(6.303±1.702),p0.05]與合成TGFβ1 [(3.114±0.4693) vs. (1.000±0.1583),p0.01], CTGF [(1.509±0.3355) vs. (1.000±0.2980), p0.05]的能力較對照組明顯增強(qiáng)。(4) PaSCs在collagen Ⅰ上培養(yǎng)24小時,α3整合素[(1.336±0.2262)vs.(1.000±0.2627),p0.05]和β1整合素[(2.078±0.06824)vs.(1.000±0.3220),p0.01]蛋白表達(dá)水平高于對照組。(5) PaSCs在collagen Ⅰ上培養(yǎng)24小時,FAK[(2.026±0.3769) vs. (1.000±0.08664), p0.05], ERK [(1.542±0.6009) vs. (1.000 ±0.6367), p0.01], AKT [(3.026±0.6649) vs. (1.000±0.3501), p0.01]的磷酸化和cyclinD1的蛋白表達(dá)水平[(1.186±0.2012)vs.(1.000±0.1933),p0.001]明顯高于對照組。結(jié)論：PaSCs高表達(dá)α3β1整合素受體。Collagen Ⅰ激活α3β1整合素受體,相互作用促進(jìn)細(xì)胞的粘附,遷移,增殖和生長因子的合成,同時激活FAK/ERK和PI3K/AKT信號通路。第三部分中和抗體阻斷β1整合素受體對胰腺星狀細(xì)胞功能和增殖的影響目的：采用β1整合素中和抗體阻斷其活性,進(jìn)一步明確β1整合素受體與collagen I相互作用對胎兒PaSCs活性和增殖的影響及其相關(guān)的分子機(jī)制。方法：(1)分別用抗人β1整合素抗體,人IgG2a同種型陰性對照,或新鮮的無血清培養(yǎng)基預(yù)處理PaSCs1小時。(2)通過細(xì)胞粘附實驗和創(chuàng)傷劃痕實驗觀察不同預(yù)處理的PaSCs培養(yǎng)在collagen Ⅰ上,細(xì)胞粘附力和遷移力的改變。(3)不同預(yù)處理的PaSCs在collagen Ⅰ培養(yǎng)24小時后,通過Ki67免疫熒光染色檢測細(xì)胞的增殖能力,蛋白印跡實驗檢測PaSCs合成生長因子(TGFβ1和CTGF)的能力。(4)蛋白印跡實驗檢測相關(guān)下游信號分子(FAK,ERK,AKT, cyclinD1)的活性。結(jié)果：(1)細(xì)胞粘附實驗和創(chuàng)傷劃痕實驗結(jié)果表明,抗人β1整合素抗體預(yù)處理的PaSCs在collagen Ⅰ上的粘附力[(0.4750±0.02372)vs.(1.000±0.06726)(0.9275±0.05621),p0.01-0.001]和遷移力顯著低于對照組,IgG2a預(yù)處理的PaSCs與空白對照組預(yù)處理的細(xì)胞相比無明顯變化[(0.9275±0.05621)vs.(1.000±0.06726),p0.05]。(2)功能性阻斷p1整合素受體,PaSCs的細(xì)胞增殖能力[(4.913±0.4373) vs.(11.76±1.127)(9.957±1.041), p0.05-0.01],TGFβ1[(0.3932±0.06421) vs.(1.000±0.1464)(0.9505±0.2482), p0.05]和CTGF的合成[(0.5914±0.1294) vs.(1.000±0.08527)(1.154± 0.1290),p0.05=0.01]明顯低于空白對照組和IgG2a預(yù)處理組。(3)蛋白印跡實驗結(jié)果顯示阻斷β1整合素受體,下游FAK[(0.2320±0.03216)vs.(1.000± 0.2324)(0.9152±0.1274),p0.05],ERK[(0.3765±0.05115)vs.(1.000±0.1118) (1.142±0.1313),p0.05-0.01]的磷酸化和cyclinD1的蛋白表達(dá)水平[(0.6149±0.09029)vs.(1.000±0.08192)(0.9749±0.04767),p0.05-0.01]明顯低于對照組,但對AKT的磷酸化水平無影響[(1.218±0.1099)vs.(1.000±1.229)(1.239±0.1276),p0.05]。結(jié)論：阻斷β1整合素受體顯著降低PaSCs的粘附和遷移力,抑制細(xì)胞增殖與生長因子的合成,伴隨FAK/ERK/cyclinD1信號通路的下調(diào)。
【關(guān)鍵詞】：胎兒胰腺 胰腺星狀細(xì)胞 胰腺發(fā)育 胰腺星狀細(xì)胞 整合素受體 細(xì)胞外基質(zhì) 信號通路 胰腺星狀細(xì)胞 整合素受體 Ⅰ型膠原蛋白 信號通路
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 中文摘要5-11
• 英文摘要11-18
• 縮略詞表18-22
• 前言22-36
• 文獻(xiàn)綜述36-47
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 第一部分：人胎兒胰腺星狀細(xì)胞的分離和鑒定47-69
• 材料和方法47-58
• 實驗結(jié)果58-64
• 討論64-69
• 第二部分：αβ1整合素在胎兒胰腺星狀細(xì)胞的表達(dá)和功能69-96
• 材料和方法70-81
• 實驗結(jié)果81-92
• 討論92-96
• 第三部分：中和抗體阻斷β1整合素受體對胰腺星狀細(xì)胞功能和增殖的影響96-118
• 材料和方法96-106
• 實驗結(jié)果106-115
• 討論115-118
• 結(jié)論118-119
• 參考文獻(xiàn)119-145
• 作者簡介145-146
• 致謝146-147
• 附件147-152

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