本文關鍵詞：膿毒癥的細胞生物治療新機制—間充質干細胞抑制巨噬細胞炎癥復合體3的激活，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的膿毒癥以其高發(fā)生率和高死亡率業(yè)已成為全球公共衛(wèi)生的挑戰(zhàn)。膿毒癥本質上是感染引發(fā)的宿主免疫、炎癥和凝血機制失調,但由于宿主反應的復雜性和多樣性,決定了單一針對膿毒癥發(fā)病機制中某一關鍵介質或調控環(huán)節(jié)的治療措施效果并不顯著,只有從整體上逆轉宿主體內免疫反應平衡才能維持重要臟器功能,并有效防治膿毒癥。間充質干細胞具有多種生物學效應,能夠維系炎癥反應、抗炎反應及免疫抑制之間動態(tài)平衡,已作為膿毒癥生物治療的潛在策略。然而,移植細胞的作用機制不清,治療獲益有限,嚴重限制了膿毒癥細胞生物學治療的臨床轉化。課題針對當前膿毒癥細胞治療機制不明的問題,通過建立盲腸結扎穿孔致膿毒癥的小鼠動物模型,分別在整體水平和細胞水平觀察骨髓來源的間充質干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的治療作用及對巨噬細胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDMs)的抗炎調節(jié)作用,闡明BMSCs移植對治療膿毒癥的作用機制,明確膿毒癥生物治療的關鍵分子靶點,通過機制干預,優(yōu)化細胞治療策略。研究方法原代分離、培養(yǎng)、鑒定B6-e GFP轉基因小鼠的BMSC及成纖維細胞(Fb),建立盲腸結扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)模型,術后尾靜脈注射鹽水、Fb或BMSCs,計算96小時內小鼠生存率,超聲心動圖測定左室收縮功能,生物技能實驗系統(tǒng)檢測血流動力學,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清臟器損傷指標及炎癥因子水平,共聚焦顯微鏡觀察BMSCs的歸巢情況,蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察小鼠臟器組織病理變化,免疫組織化學及免疫熒光染色觀察小鼠臟器炎性細胞浸潤,Western Blot免疫印跡試驗檢測組織的蛋白水平。原代分離、培養(yǎng)及鑒定BMDMs,體外LPS和ATP干預并與BMSCs共培養(yǎng),ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清炎癥因子水平,流式細胞術檢測BMDMs線粒體ROS生成,透射電子顯微鏡觀察BMDMs線粒體形態(tài),免疫熒光染色觀察NLRP3和LC3B的亞細胞定位,Western Blot檢測BMDMs P2X7、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、PINK1、Parkin和LC3B的蛋白水平。研究結果1.觀察96h小鼠生存率,膿毒癥鹽水組小鼠生存率為10%,膿毒癥Fb組小鼠生存率為5%,膿毒癥BMSCs組小鼠生存率為40%,log-rank檢驗進行生存率分析結果顯示:膿毒癥BMSCs組小鼠生存率明顯高于鹽水組或Fb組,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05,P0.05),說明BMSCs靜脈輸注可提高膿毒癥小鼠的生存率。2.各臟器組織冰凍切片可見BMSCs較多定植于肝臟;病理切片HE染色可見膿毒癥BMSCs組各臟器充血、水腫及炎性細胞浸潤減少;ELISA結果顯示膿毒癥BMSCs組血清中各臟器損傷的生物標志物水平下降;超聲心動圖結果顯示膿毒癥BMSCs與膿毒癥鹽水組和Fb組相比,LVEF,LVFS均明顯升高(P0.05,P0.05),(P0.05,P0.05),血流動力學結果顯示與膿毒癥鹽水組和Fb組相比,注射BMSCs顯著改善小鼠心室收縮/舒張功能(與鹽水組相比:+dp/dp:P0.05,-dp/dp:P0.01;與Fb組相比:+dp/dp:P0.05;-dp/dp:P0.05),說明BMSCs輔助治療改善膿毒癥所致心臟功能下降;免疫組織化學和免疫熒光染色可見膿毒癥BMSCs組各臟器組織中的中性粒細胞(Ly-6G+細胞)和巨噬細胞(MAC-3+細胞)減少。ELISA結果顯示與膿毒癥鹽水組和Fb組相比,血清IL-1β水平均明顯降低(,P0.01,P0.05)。血清IL-6、TNF-a水平變化趨勢與IL-1β水平變化一致,血清IL-10水平均明顯升高(P0.05,P0.05);肝臟組織蛋白Western Blot結果顯示膿毒癥BMSCs組與膿毒癥鹽水組及Fb組相比,casp-1 p20表達顯著下降(P0.05,P0.05),IL-1βp17表達顯著下降(P0.05,P0.05),說明BMSC輔助治療膿毒癥與抑制炎癥復合體3的激活有關。3.流式細胞術結果顯示BMSCs共培養(yǎng)LPS和ATP刺激組線粒體氧化陰離子(O2-)生成下降,線粒體膜電位上升,說明BMSCs減輕LPS和ATP干預對BMDMs線粒體的損傷;線粒體、NLRP3與細胞核共定位免疫熒光染色結果表明BMSCs改變NLRP3在巨噬細胞中的分布;BMDMs蛋白Western Blot及培養(yǎng)上清ELISA結果顯示經過Mito-TEMPO處理后BMSCs共培養(yǎng)LPS和ATP刺激組caspase-1p20及IL-1βp17表達顯著下降(P0.05,P0.01),IL-1β和IL-18水平顯著降低(P0.05,P0.05),說明BMSCs對BMDMs的調節(jié)作用與其抑制炎癥復合體3激活有關,且這個過程可能需要線粒體ROS的參與。4.透射電鏡觀察顯示BMSCs共培養(yǎng)LPS和ATP刺激組線粒體空泡樣變減少,線粒體自噬體增加;線粒體、LC3B蛋白與細胞核共定位免疫熒光染色結果表明,BMSCs共培養(yǎng)LPS和ATP刺激組,LC3B由均勻分布轉為明顯的斑點狀聚集,并且與線粒體重合增多,說明BMSC組線粒體自噬加劇;BMDMs蛋白Western Blot及培養(yǎng)上清ELISA結果顯示BMSCs共培養(yǎng)LPS和ATP刺激組經過3-MA處理后,caspase-1 p20及IL-1βp17表達顯著上升(P0.01,P0.05),IL-1β和IL-18分泌顯著增多(P0.05,P0.05),說明自噬參與了BMSCs抑制BMDMs炎癥復合體3激活的調節(jié)。5.BMDMs蛋白Western Blot結果顯示:BMSCs共培養(yǎng)LPS和ATP刺激組經過Mito-TEMPO處理后PINK1和Parkin表達量以及LC3BⅡ/Ⅰ比例顯著下降(P0.01,P0.01,P0.01),說明BMSCs經由PINK1/Parkin途徑增加LPS和ATP干預后BMDMs的線粒體自噬,且這個過程可能需要線粒體ROS的參與;流式結果顯示3-MA干預后的BMSCs共培養(yǎng)LPS和ATP刺激組線粒體釋放ROS增多,說明BMSC通過增加LPS和ATP刺激后BMDMs的線粒體自噬,減少線粒體ROS的生成。研究結論1.發(fā)現(xiàn)BMSCs輔助治療能夠提高膿毒癥小鼠生存率;減輕膿毒癥所致重要臟器的病理損傷,改善膿毒癥所致重要臟器的功能,改善膿毒癥所致心臟功能下降;減輕膿毒癥所致重要臟器炎性細胞浸潤,降低膿毒癥血清炎癥因子水平,證實了BMSCs輔助治療膿毒癥的有效性,闡明BMSCs移植對膿毒癥小鼠治療作用的機制可能與其抑制炎癥復合體3的激活有關。2.發(fā)現(xiàn)BMSCs通過PINK1/Parkin途徑增加LPS和ATP干預后BMDMs的線粒體自噬,減少線粒體的損傷和ROS產生,從而抑制炎癥復合體3的激活,闡明了BMSCs與巨噬細胞相互作用與激活炎癥復合體3之間的關系,明確了膿毒癥生物治療可能存在的分子靶點。
【關鍵詞】：膿毒癥 間充質干細胞 巨噬細胞 炎癥復合體 線粒體自噬
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-17
• 文獻回顧17-36
• 第一部分 骨髓間充質干細胞對小鼠盲腸結扎穿孔致膿毒癥的治療作用36-58
• 1 材料36-38
• 2 方法38-45
• 2.1 BMSCs的原代分離、培養(yǎng)、鑒定38-39
• 2.2 成纖維細胞的分離、培養(yǎng)39-40
• 2.3 膿毒癥小鼠模型的建立及實驗分組40-42
• 2.4 觀察BMSCs在體內的分布42
• 2.5 小鼠生存率觀察42
• 2.6 左室收縮功能測定42
• 2.7 心臟血流動力學檢測42
• 2.8 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測小鼠血清臟器損傷指標及炎癥因子水平42-43
• 2.9 蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察小鼠臟器組織病理變化43
• 2.10免疫組織化學染色（SP法）觀察小鼠臟器炎性細胞浸潤43-44
• 2.11免疫熒光染色觀察小鼠臟器炎性細胞浸潤44
• 2.12 Western Blot檢測肝臟組織的蛋白水平44-45
• 2.13統(tǒng)計學分析45
• 3 結果45-54
• 3.1 BMSCs的生物學特征45-46
• 3.2 BMSCs輔助治療改善膿毒癥小鼠的一般狀況46-47
• 3.3 尾靜脈注射BMSCs在膿毒癥小鼠重要臟器的定植情況47
• 3.4 BMSCs輔助治療提高膿毒癥小鼠生存率47-48
• 3.5 BMSCs輔助治療減輕膿毒癥所致重要臟器的病理損傷48
• 3.6 BMSCs輔助治療改善膿毒癥所致重要臟器的功能48-50
• 3.7 BMSCs輔助治療改善膿毒癥所致心臟功能下降50-51
• 3.8 BMSCs輔助治療減輕膿毒癥所致重要臟器炎性細胞浸潤51-52
• 3.9 BMSCs輔助治療調節(jié)膿毒癥血清炎癥因子水平52-53
• 3.10 BMSC e GFP+輔助治療膿毒癥與抑制炎癥復合體3的激活有關53-54
• 4 討論54-57
• 小結57-58
• 第二部分 骨髓間充質干細胞對骨髓來源巨噬細胞調節(jié)作用的機制研究58-74
• 1 材料58-59
• 2 方法59-63
• 2.1 BMSCs的原代分離、培養(yǎng)、鑒定59
• 2.2 BMDMs的原代分離、培養(yǎng)、鑒定59-60
• 2.3 細胞培養(yǎng)分組及干預60
• 2.4 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清炎癥因子水平60-61
• 2.5 流式細胞術檢測BMDMs線粒體ROS生成61
• 2.6 免疫熒光染色觀察BMDMs的NLRP3 和LC3B亞細胞定位61-62
• 2.7 透射電子顯微鏡觀察BMDMs線粒體形態(tài)62
• 2.8 Western Blot檢測BMDMs的蛋白水平62
• 2.9 統(tǒng)計學分析62-63
• 3 結果63-71
• 3.1 BMDMs的生物學特征63
• 3.2 BMSCs對BMDMs的調節(jié)作用與炎癥復合體3激活有關63-65
• 3.3 BMSCs減少LPS和ATP干預后BMDMs線粒體的損傷和ROS產生65
• 3.4 BMSCs改變LPS和ATP干預后NLRP3 在BMDMs中的分布65-66
• 3.5 BMSCs通過減少LPS和ATP干預后BMDMs線粒體的損傷和ROS產生,抑制炎癥復合體3的激活66-67
• 3.6 BMSCs增加LPS和ATP干預后BMDMs的線粒體自噬67-68
• 3.7 BMSCs通過增加LPS和ATP干預后BMDMs的線粒體自噬,抑制炎癥復合體3的激活68-69
• 3.8 BMSCs通過PINK1/Parkin途徑增加LPS和ATP干預后BMDMs的線粒體自噬,減少線粒體ROS的生成69-71
• 4 討論71-72
• 小結72-74
• 結論74-75
• 參考文獻75-91
• 個人簡歷和研究成果91-95
• 致謝95

  本文關鍵詞：膿毒癥的細胞生物治療新機制—間充質干細胞抑制巨噬細胞炎癥復合體3的激活，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：295174