本文關(guān)鍵詞：p53基因表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制的在體研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：p53(或稱Trp53,腫瘤轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白53)是最重要的應(yīng)激和抑癌因子之一。p53的活性可被兩個層次的機(jī)制所調(diào)控。MDM2和MDMX (MDM4)是最主要的兩個p53負(fù)向調(diào)控因子。去除(釋放)MDM2和MDMX抑制效應(yīng)是翻譯后水平的p53活性調(diào)控機(jī)制的核心,由各種應(yīng)激信號所誘導(dǎo)的p53、MDM2和MDMX的磷酸化所導(dǎo)致的MDM2和MDMX與p53蛋白不再結(jié)合,使得p53蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性大大增強(qiáng)。p53基因的表達(dá)調(diào)控是p53調(diào)控的另一層次的機(jī)制,越來越多的證據(jù)提示該調(diào)控機(jī)制的重要性。p53的轉(zhuǎn)錄活性和其劑量直接相關(guān),處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞或組織對應(yīng)激和死亡信號的敏感性增加并且與p53的活性有關(guān)。一些細(xì)胞實驗的結(jié)果暗示增殖狀態(tài)與p53的表達(dá)之間也可能存在聯(lián)系。多種與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路均能激活c-MYC,c-MYC屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族(basic helix-loop-helix-Leucine zipper,bHLH-LZ),它能結(jié)合到E-box (CANNTG)元件上調(diào)控多種基因的表達(dá),是細(xì)胞生存、增殖、胚胎發(fā)育、甚至是促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展所必需的因子。另外,體外的一些數(shù)據(jù)提示p533'UTR可能在p53表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控中起作用。為了方便在廣泛的組織中比較精確地研究p53mRNA的表達(dá)模式,深入探討增殖狀態(tài)與p53表達(dá)之間的聯(lián)系,以及重要順式元件和相關(guān)反式作用因子對p53表達(dá)的調(diào)控作用,我們首先通過BAC轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功地構(gòu)建了四株由不同p53表達(dá)調(diào)控元件驅(qū)動的體內(nèi)LacZ小鼠報告系統(tǒng)：p53-LacZ (包括p53ZPE、 p53EMZPE、p53ZEP和p53EMZEP小鼠,詳細(xì)介紹見第二章)。通過分析p53ZPE小鼠(與原位雜交的比對分析證實其LacZ能表征野生型p53的表達(dá))β-gal的活性和模式,我們發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)組織,尤其是自我更新旺盛的組織中增殖狀態(tài)和高水平p53啟動子活性之間存在正向的緊密聯(lián)系,即只有增殖細(xì)胞驅(qū)動高水平LacZ的表達(dá)。我們在p53ZPE小鼠胚胎(10.5天)、幼年的組織(包括p7-8天的小腸、皮膚、骨髓、睪丸、小腦和海馬的齒狀回等)、自我更新的穩(wěn)態(tài)組織(包括2-3個月的小腸、皮膚、睪丸、骨髓和海馬的齒狀回等)和小腸息肉中都觀察到增殖區(qū)域及細(xì)胞表達(dá)高水平的β-gal,且β-gal蛋白與增殖細(xì)胞標(biāo)記物Ki67共定位。通過比較p7-8天,2-3月和13-15月同種組織中β-gal的表達(dá)水平,我們發(fā)現(xiàn)很多組織中β-gal表達(dá)水平存在隨年齡增大而下降的趨勢。與組織表達(dá)的結(jié)果相對應(yīng),p53ZPE小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在血清的刺激下,LacZ和內(nèi)源性p53 mRNA的表達(dá)模式彼此一致,兩者的表達(dá)都從細(xì)胞進(jìn)入周期開始較弱到細(xì)胞進(jìn)入復(fù)制時變強(qiáng)、而在細(xì)胞分裂即將結(jié)束時又開始下降。通過比較p53ZPE和p53EMZP、p53ZEP和p53EMZEP及p53ZPE和p53ZEP幾組小鼠之間LacZ的表達(dá)水平,我們進(jìn)一步確定了小鼠p53啟動子上一個保守的E-box序列和p53 3'UTR序列對于胚胎(10.5天)和多種幼年和成年組織(p7-10、2-5月的小腸、皮膚、骨髓、睪丸、腎臟和肝臟等)中β-gal的高表達(dá)是必需的。其中,BAC轉(zhuǎn)基因小鼠中E-box的突變(EM)十分顯著地下調(diào)了LacZ mRNA (Q-PCR)和β-gal (X-gal染色)的表達(dá)水平；實驗數(shù)據(jù)還表明該突變對LacZmRNA水平的下調(diào)作用在2-5月的成年組織中最明顯、其次是p8-10天的幼年組織,影響稍小的是10.5天的胚胎。在小鼠的胚胎(E10.5-E11.5)和成年的快速更新組織(小腸、胰腺)中所進(jìn)行的ChIP實驗的結(jié)果表明,E-box突變使c-MYC喪失了結(jié)合p53啟動子的能力；而通過采用抑制c-MYC-MAX二聚體形成的藥物10058-F4處理增殖中的p53ZPE小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,則明顯抑制了c-MYC結(jié)合p53啟動子的能力并同時顯著下調(diào)BAC轉(zhuǎn)基因LacZ和內(nèi)源性p53 mRNA的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)說明c-MYC在增殖細(xì)胞中可通過E-box調(diào)控p53的表達(dá),是影響p53表達(dá)模式的關(guān)鍵因子。另一方面,p533'UTR的缺失并不顯著影響B(tài)AC轉(zhuǎn)基因小鼠LacZ mRNA的表達(dá),卻大幅下調(diào)了β-gal的表達(dá),提示p533'UTR可能通過轉(zhuǎn)錄后的翻譯調(diào)控正向影響基因表達(dá)。基于對多種組織中增殖細(xì)胞表達(dá)高水平p53及其調(diào)控模式及元件的認(rèn)識,我們建立了用于標(biāo)記和跟蹤增殖細(xì)胞的可誘導(dǎo)的p53ERT2CreERT2-IRES-EGFP(以下簡稱p53-EC E)小鼠,并進(jìn)行了初步的譜系跟蹤實驗。數(shù)據(jù)表明,p53-ECE小鼠結(jié)合ROSA26報告系統(tǒng)可用于標(biāo)記和跟蹤多種組織中(如小腸、皮膚毛囊、小腦等)的增殖細(xì)胞及其衍生細(xì)胞：在p6天經(jīng)Tamoxifen誘導(dǎo)后短時間內(nèi)(24-36小時)p53-ECE；ROSA26-LSL-LacZ小鼠與p53ZPE報告小鼠有相同的β-gal標(biāo)記模式,而經(jīng)Tamoxifen誘導(dǎo)后較長時期后(1-2個月)則可以觀察到陽性標(biāo)記的克隆細(xì)胞群。我們的研究首次明確地發(fā)現(xiàn)和指出小鼠多種組織的增殖細(xì)胞中高表達(dá)p53mRNA的模式。另外,p53 3’UTR還可促進(jìn)其有效的翻譯、合成新蛋白。受到MDM2泛素化連接酶等負(fù)向因子調(diào)控,生理狀態(tài)下組織和細(xì)胞中p53蛋白含量極低,難以用常規(guī)方法檢測。由于處于增殖期的細(xì)胞對腫瘤相關(guān)惡性變化易感,我們的發(fā)現(xiàn)提示,細(xì)胞的增殖狀態(tài)受到了p53的嚴(yán)格監(jiān)控,一旦出現(xiàn)應(yīng)激信號,MDM2和MDMX(MDM4)等負(fù)向調(diào)控被釋放,大量新合成的p53蛋白不再被降解,便可產(chǎn)生快速和強(qiáng)勁的細(xì)胞響應(yīng),影響和決定細(xì)胞的命運(yùn)。因此,p53基因表達(dá)層面的調(diào)控是與p53作為快速應(yīng)激和抑癌因子功能相匹配的重要一環(huán)。我們的研究還揭示出c-MYC和p53啟動子區(qū)域保守的E-box在p53的表達(dá)中起到的關(guān)鍵的作用,提示來自增殖細(xì)胞的信號反饋至p53,成為預(yù)警信號。而且,我們的工作建立了研究體內(nèi)“靜止?fàn)顟B(tài)”p53的表達(dá)模式和調(diào)控機(jī)制的體系：p53-LacZ報告系統(tǒng),以及可用于研究增殖細(xì)胞及其衍生細(xì)胞的“動態(tài)演變過程”的p53-ECE小鼠,將對后續(xù)研究產(chǎn)生推動。
【關(guān)鍵詞】：p53 表達(dá)模式 調(diào)控機(jī)制 c-MYC E-box p533'UTR BAC轉(zhuǎn)基因 LacZ β-gal ERT2CreERT2 增殖 體內(nèi)
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 主要中英文名詞對照表14-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-52
• 1.1 前言15-16
• 1.2 p53的功能-基因組的保護(hù)者16-19
• 1.3 細(xì)胞增殖狀態(tài)加強(qiáng)了細(xì)胞和機(jī)體對應(yīng)激和死亡信號的靈敏性且該現(xiàn)象與p53的活力直接相關(guān)19-23
• 1.3.1 細(xì)胞增殖的激發(fā)、維持和細(xì)胞周期監(jiān)測點的失調(diào)是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的前提19-21
• 1.3.2 細(xì)胞增殖信號通路與c-MYC蛋白21-22
• 1.3.3 增殖狀態(tài)加強(qiáng)了細(xì)胞和機(jī)體對應(yīng)激信號和死亡信號的靈敏性且該現(xiàn)象與p53的活力直接相關(guān)22-23
• 1.4 p53活力的調(diào)控23-35
• 1.4.1 p53蛋白的翻譯后調(diào)控23-26
• 1.4.2 p53mRNA表達(dá)、翻譯及其調(diào)控的研究現(xiàn)狀26-35
• 1.5 BAC轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠在研究體內(nèi)基因的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制和譜系跟蹤中的應(yīng)用35-38
• 1.5.1 應(yīng)用BAC轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建報告基因小鼠并用于研究體內(nèi)基因的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制35-37
• 1.5.2 應(yīng)用BAC轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建Cre小鼠并用于譜系跟蹤研究37-38
• 1.6 結(jié)語38-40
• 參考文獻(xiàn)40-52
• 第二章 p53RNA表達(dá)及其調(diào)控初探和四株BAC轉(zhuǎn)基因p53-LacZ報告小鼠的構(gòu)建52-78
• 摘要52-53
• 前言53-54
• 材料與方法54-73
• 2.1 利用原位雜交技術(shù)觀察三種組織中p53 mRNA的表達(dá)情況62-64
• 2.2 利用染色體免疫共沉淀技術(shù)考察c-MYC結(jié)合NIH3T3細(xì)胞中p53啟動子的情況64-65
• 2.3 利用BAC轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建四株p53-LacZ報告小鼠65-73
• 2.3.1 構(gòu)建四種修飾后的p53 BAC66-67
• 2.3.2 鑒定BAC的穩(wěn)定性和完整性67-68
• 2.3.3 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠68-69
• 2.3.4 估算各個品系小鼠中轉(zhuǎn)入BAC的拷貝數(shù)69-71
• 2.3.5 檢測和比較p53 BAC轉(zhuǎn)基因小鼠各株各品系10.5天胚胎的β-gal表達(dá)模式和水平71-73
• 2.3.6 檢測ZPE小鼠中的β-gal表達(dá)水平和模式并與原位雜交的數(shù)據(jù)相比較73
• 討論73-75
• 參考文獻(xiàn)75-78
• 第三章 在小鼠的多種組織中探討p53表達(dá)的主要模式78-96
• 摘要78-79
• 前言79-81
• 材料與方法81-91
• 3.1 ZPE50 MEF中LacZ和內(nèi)源性p53 mRNA表達(dá)模式相互一致且高水平的β-gal和細(xì)胞的增殖狀態(tài)存在正向相關(guān)性84-85
• 3.2 β-gal的表達(dá)水平與小鼠皮膚毛囊的增殖狀態(tài)成正相關(guān)85-86
• 3.3 高水平β-gal能在多種組織中與Ki67共定位86-89
• 3.4 多種組織中增殖細(xì)胞表達(dá)高水平的β-gal且其水平有隨年齡增加而下降的趨勢89-90
• 3.5 ZPE50;APC~(min)小鼠產(chǎn)生的小腸息肉廣泛異位表達(dá)高水平β-gal且其表達(dá)模式和Ki67一致90-91
• 討論91-93
• 參考文獻(xiàn)93-96
• 第四章 在小鼠多種組織中探討p53啟動子中保守的E-box和p53 3'UTR對p3，UTR對p53表達(dá)調(diào)控的作用96-117
• 摘要96-97
• 前言97-98
• 材料與方法98-110
• 4.1 p53啟動區(qū)域E-box突變顯著下調(diào)了胚胎、幼年期和成年期小鼠多種組織中LacZ mRNA和p-gal的水平101-104
• 4.2 c-MYC在增殖細(xì)胞中通過p53啟動區(qū)域E-box調(diào)控p53的表達(dá)104-106
• 4.3 去除p53 3'UTR大幅下調(diào)了BAC轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎、幼年期和成年期多種組織中β-gal的表達(dá)水平而不顯著影響LacZ mRNA的水平106-110
• 討論110-113
• 參考文獻(xiàn)113-117
• 第五章 建立p53~(ERT2CreERT2-IRES-EGFP)小鼠并結(jié)合ROSA26報告系統(tǒng)對多種組織中增殖細(xì)胞進(jìn)行譜系跟蹤117-129
• 摘要117-118
• 前言118-119
• 材料與方法119-126
• 5.1 構(gòu)建p53~(ERT2CreERT2-IRES-EGFP)(簡稱p53-ECE)小鼠122-124
• 5.1.1 構(gòu)建p53-ECE BAC122-123
• 5.1.2 構(gòu)建p53-ECE轉(zhuǎn)基因小鼠123-124
• 5.2 利用p53-ECE;LSL-LacZ小鼠檢測Cre的活性及其標(biāo)記和跟蹤增殖細(xì)胞的情況124-126
• 討論126-127
• 參考文獻(xiàn)127-129
• 致謝129-130
• Publications130-131

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 韓紀(jì)昌;魏玉菊;王伯章;張yN捷;李四紅;;常壓低氧性肺動脈高壓p53基因表達(dá)及意義的試驗研究[J];中外醫(yī)療;2009年07期

2 劉斌,朱秀安;遺傳性視網(wǎng)膜變性視細(xì)胞凋亡與p53基因表達(dá)[J];中華眼科雜志;2000年01期

3 李月進(jìn),丘瑩;肺癌p53基因表達(dá)和突變的研究[J];腫瘤防治雜志;2000年05期

4 謝民強(qiáng),肖健云,陶正德,羅均利;人喉癌中p53基因表達(dá)和人乳頭狀瘤病毒感染的初步研究[J];湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1997年03期

5 陳文斌,王偉林,鄭樹森,朱偉芳;原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞凋亡及p53基因表達(dá)的研究[J];浙江醫(yī)學(xué);2001年01期

6 楊懷安,樸哲孝治,高坂知節(jié);喉癌p53基因表達(dá)與放療效果的關(guān)系[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;1998年01期

7 麻玲玲,李貴容,楊品,辛?xí)匝?卵巢惡性腫瘤p53基因表達(dá)產(chǎn)物及檢測p53第七外顯子突變的初步分析研究[J];腫瘤研究與臨床;1998年02期

8 朱慶均,鄭廣娟,王江東,張丹;白術(shù)對S_(180)荷瘤小鼠瘤組織p53基因表達(dá)的影響[J];山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2004年05期

9 陳莉延;韓紀(jì)昌;梁標(biāo);;白藜蘆醇苷對慢性低氧性肺動脈高壓大鼠肺內(nèi)突變型p53基因表達(dá)的影響[J];山東醫(yī)藥;2006年13期

10 江海東;;普洱茶對胃癌前病變大鼠p53基因表達(dá)的影響[J];中國社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學(xué)專業(yè));2011年10期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳來;p53基因表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制的在體研究[D];南京大學(xué);2015年

2 董倫;人腦膠質(zhì)瘤EGFR和p53基因表達(dá)以及EGFR反義RNA與p53基因聯(lián)合轉(zhuǎn)導(dǎo)對膠質(zhì)瘤生長抑瘤作用的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2004年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 張慶梅;樹舌多糖GF對小鼠HepA瘤p53基因表達(dá)的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2002年

2 姜琪;我國不同產(chǎn)地溫石棉及代用纖維對中國倉鼠肺細(xì)胞p73和p53基因表達(dá)的影響[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2011年

3 鄭芳;白術(shù)與甘草配伍對IEC-6細(xì)胞增殖及p21、p53基因表達(dá)的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2012年

4 胡軍;胃癌中p16，nm23-H1和p53基因表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系[D];南華大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：p53基因表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制的在體研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：295422