發(fā)布時(shí)間：2017-07-04 01:07

  本文關(guān)鍵詞：miR-34c與CRFR1調(diào)節(jié)大鼠青少年早期應(yīng)激經(jīng)歷致創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙易感性

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【摘要】：1.前言創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder, PTSD)是一種特殊形式的焦慮障礙,是指?jìng)�(gè)體在經(jīng)歷或目睹異乎尋常的、嚴(yán)重的威脅性或?yàn)?zāi)難性事件后所導(dǎo)致的延遲出現(xiàn)和持續(xù)存在的反應(yīng)。有研究證實(shí),下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamus-Pituitary-adrenal, HPA)軸的異常激活會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂和行為異常。因此,HPA軸的功能紊亂是PTSD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因子之一。多項(xiàng)研究結(jié)果表明,PTSD的發(fā)病涉及促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotrophin releasing factor, CRF)過度分泌或應(yīng)激源誘導(dǎo)的CRH過度反應(yīng)。作為激活和調(diào)節(jié)HPA軸功能的上游關(guān)鍵因子,CRF及其受體CRFR1 (corticotrophin releasing factor receptor 1)在焦慮、抑郁和PTSD等情感障礙的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要角色。眾多研究證實(shí),個(gè)體對(duì)PTSD的易感性存在差異,而早年應(yīng)激經(jīng)歷是導(dǎo)致PTSD易感性增加的重要因素之一。青少年時(shí)期是個(gè)體神經(jīng)生物和行為發(fā)展的一個(gè)非常關(guān)鍵和特殊的時(shí)期,在這期間我們可以觀察到邊緣系統(tǒng)和前額葉皮質(zhì)區(qū)域的特異性改變。在個(gè)體早年發(fā)育期間對(duì)CRF受體的表達(dá)及其功能進(jìn)行調(diào)節(jié)可能是其相關(guān)神經(jīng)元功能失調(diào)的重要原因,并且該影響可能會(huì)持續(xù)終生,這無疑會(huì)增加成年期罹患應(yīng)激相關(guān)疾病的易感性。另外,表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn),小鼠暴露于應(yīng)激環(huán)境時(shí),杏仁核miR-34c表達(dá)水平升高,焦慮樣行為降低,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-34c作用的靶點(diǎn)之一是CRFR1mRNA。但對(duì)早年應(yīng)激經(jīng)歷與CRFR1和miR-34c以及PTSD易感性關(guān)系的研究非常有限。許多研究均證實(shí),運(yùn)動(dòng)作為一種潛在的非藥物治療手段,對(duì)大腦功能以及神經(jīng)元可塑性都大有裨益。本實(shí)驗(yàn)聚焦青少年期創(chuàng)傷應(yīng)激對(duì)成年動(dòng)物焦慮、抑郁行為、HPA軸功能、中樞CRFR1和miR-34c的影響,揭示CRFR1和miR-34c在早年經(jīng)歷致PTSD發(fā)病易感性中的作用,以及規(guī)律跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)PTSD樣癥狀的調(diào)節(jié)作用。2.研究目的(1)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激對(duì)成年期焦慮與抑郁樣行為、記憶、HPA軸功能及CRFR1表達(dá)的作用。(2)規(guī)律跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)與CRFR1拮抗劑對(duì)行為、HPA軸功能及CRFR1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。(3)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激對(duì)行為學(xué)、CRFR1、CRFR1 mRNA和miR-34c表達(dá)的短期和長期作用；CRFR1拮抗劑對(duì)上述指標(biāo)的改善作用。3.材料和方法(1)實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)一：64只雄性21日齡Wistar大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(CON)、應(yīng)激組(S)、應(yīng)激加運(yùn)動(dòng)組(S+E)和應(yīng)激加拮抗劑組(S+A),每組16只。除去對(duì)照組,其它三組均制備PTSD模型。實(shí)驗(yàn)二:72只雄性21日齡Wistar大鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組(CON)、應(yīng)激組(S)和應(yīng)激加拮抗劑組(S+A),每組24只。在PTSD造模完成兩周后,每組隨機(jī)抽取12只進(jìn)行行為學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),其余12只繼續(xù)飼養(yǎng)至成年(造模完成六周后)后進(jìn)行行為學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。(2) PTSD模型制備將大鼠置于密閉不透光的電擊箱中,大鼠足部收到持續(xù)6s,連續(xù)20次不可逃避的電流刺激,電流強(qiáng)度為8mA。電擊時(shí)間間隔隨機(jī),每次持續(xù)30min。上下午各一次,間隔時(shí)間不少于4h,持續(xù)6天。(3) CRFR1拮抗劑CP-154,526的使用方法S+A組動(dòng)物在PTSD模型建立后第二天腹腔注射CRFR1拮抗劑。將拮抗劑溶于80%的聚乙烯乙二醇400中,劑量為3.2mg/kg/day,持續(xù)14天。為平衡處理誤差,其它組的動(dòng)物腹腔注射80%的聚乙烯乙二醇400。(4)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練程序?qū)嶒?yàn)一中的S+E組的動(dòng)物在PTSD模型建立后第二天開始為期六周,每周五次的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。(5) DEX/CRH聯(lián)合試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后,每組隨機(jī)抽取8只大鼠接受DEX/CRH聯(lián)合試驗(yàn)。(6)行為學(xué)測(cè)試實(shí)驗(yàn)一在造模完成六周后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試,試驗(yàn)二分別在造模完成后兩周和六周進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。行為學(xué)測(cè)試包括曠場(chǎng)試驗(yàn)、高架十字迷宮試驗(yàn),Y迷宮試驗(yàn)和Morris水迷宮測(cè)試。(7)免疫組化檢測(cè)CRFR1表達(dá)實(shí)驗(yàn)一行為學(xué)測(cè)試結(jié)束以后,隨機(jī)抽取大鼠處死,腦組織分離后用蠟塊包埋。內(nèi)側(cè)前額葉、下丘腦、海馬和杏仁核的組織切片方向?yàn)楣跔?厚度為5微米,隨后采用免疫組化染色方法檢測(cè)CRFR1表達(dá)。(8)免疫印跡分析CRFR1表達(dá)取內(nèi)側(cè)前額葉、下丘腦、海馬和杏仁核組織在冰上勻漿,勻漿液在低溫離心機(jī)中以14000轉(zhuǎn)的速度離心30分鐘,取上清液。測(cè)得蛋白濃度后以一定的比率與上樣緩沖液混合95℃加熱變性。取總量20微克的蛋白于12%的凝膠中電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。牛奶封閉后,PVDF膜加一抗4℃過夜,第二天PBST漂洗后加二抗室溫孵育一小時(shí)。PBST漂洗后加入ECL發(fā)光液顯影,條帶的灰度值使用ImageJ14.0軟件計(jì)算。(9)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CRFR1mRNA和miR-34c取50-100mg的下丘腦組織,加入1毫升Trizol提取總RNA。取1m1RNA采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法用來檢測(cè)CRFRlmRNA和miR-34c。其相對(duì)表達(dá)量用以下公式計(jì)算,2(?)-[(Ct of CRFR1mRNA)-(Ct of GAPDH)]以及2(?)-[(Ct of miR-34c)-(Ct of U6)].4.結(jié)果(1)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠成年期出現(xiàn)焦慮和抑郁樣行為、記憶功能損害、HPA軸功能失調(diào)和CRFR1表達(dá)異常。(2)長期規(guī)律的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和CRFR1拮抗劑CP-154,526的長期應(yīng)用可明顯改善大鼠中樞CRFR1的表達(dá)。與CRFR1拮抗劑相比,跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)減輕大鼠成年期的焦慮和抑郁樣行為,改善其記憶功能,穩(wěn)定HPA軸功能的效果更好。(3)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激在兩周內(nèi)導(dǎo)致大鼠焦慮樣行為增加和記憶功能損傷,同時(shí)下丘腦miR-34c表達(dá)上調(diào),CRFR1表達(dá)降低。(4)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠成年后的焦慮樣行為增加和記憶功能損傷,CRFR1表達(dá)升高,但下丘腦miR-34c表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異。(5) CRFR1拮抗劑CP-154,526明顯升高青少年期和成年期下丘腦miR-34c表達(dá)水平。5.結(jié)論(1)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠持續(xù)至成年的情緒、記憶、HPA功能以及中樞CRFR1表達(dá)異常。(2)中樞CRFR1表達(dá)異常和下丘腦miR-34c表達(dá)異常在早年應(yīng)激經(jīng)歷致成年期PTSD發(fā)病易感性中發(fā)揮重要的作用。(3)長期規(guī)律運(yùn)動(dòng)和CRFR1拮抗劑可明顯改善青少年期PTSD癥狀、改善HPA軸的功能和中樞CRFR1表達(dá)。(4) CRFR1拮抗劑可明顯升高青少年期和成年期下丘腦miR-34c表達(dá)。提示長期規(guī)律運(yùn)動(dòng)和CRFR1拮抗劑的作用靶點(diǎn)是CRFR1和miR-34c。
【關(guān)鍵詞】：創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙 易感性 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng) 拮抗劑 CRFR1 miR-34c
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：B842
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符號(hào)說明15-16
• 前言16-22
• 第一部分 青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激對(duì)成年大鼠HPA軸功能和中樞CRFR1表達(dá)的影響22-41
• 1.實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 2.實(shí)驗(yàn)方法24-31
• 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-36
• 4.討論36-39
• 5.小結(jié)39-41
• 第二部分 青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激對(duì)下丘腦miR-34c和CRFR1表達(dá)的動(dòng)態(tài)影響41-59
• 1.實(shí)驗(yàn)材料41-43
• 2.實(shí)驗(yàn)方法43-51
• 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-54
• 4.討論54-58
• 5.小結(jié)58-59
• 結(jié)論59
• 論文創(chuàng)新之處59
• 論文不足之處59-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 致謝67-68
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄68-69
• 附件69-100
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表100

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號(hào)：515803