目的:蛋白質(zhì)是生物大分子,其種類豐富、功能各異,某些純蛋白制劑已經(jīng)作為治療疾病的藥物被廣泛應(yīng)用,例如胰島素。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn),天然蛋白物質(zhì)具有抗腫瘤、抗炎和免疫等作用。研究表明,黃芪有著豐富的藥用部位,其中黃芪糖蛋白對某些疾病具有免疫抑制的作用,但未知黃芪蛋白成分是否對腫瘤細(xì)胞的生長有影響。因此本文對黃芪蛋白成分進(jìn)行提取純化,對黃芪蛋白進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選,進(jìn)一步對其抑制腫瘤及其中機(jī)制進(jìn)行探討,同時結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)RNA測序技術(shù),希望能夠提高黃芪活性成分的充分利用率,對蛋白類成分抗腫瘤研究提供實驗基礎(chǔ)。方法:黃芪通過水提鹽析及脫鹽,得到含有不同分子量的黃芪蛋白溶液。從三種不同的腫瘤細(xì)胞中篩選,選擇受黃芪蛋白調(diào)控變化最顯著的一種;細(xì)胞計數(shù)法計算黃芪蛋白對腫瘤細(xì)胞的增值抑制率;采用流式細(xì)胞術(shù)和PI染色法,觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死;進(jìn)一步顯微鏡下Hoechst33342和PI共同染色,分辨活細(xì)胞與死細(xì)胞個數(shù)改變情況;Western Blot法檢測凋亡標(biāo)志蛋白PARP和caspase-3磷酸化水平、壞死標(biāo)志蛋白RIP1含量變化;轉(zhuǎn)錄組學(xué)對比空白組與加藥組,分析黃芪蛋白處理后基因差異表達(dá)與信號通路改變... 

【文章來源】：山西中醫(yī)藥大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線與凝膠電泳結(jié)果

根據(jù)圖3得出：實驗期間，在同一時間內(nèi)，黃芪蛋白處理的濃度逐漸升高，同時HepG2細(xì)胞生長受到的抑制隨之增強(qiáng)；在同一濃度下，黃芪蛋白處理的時間逐漸上升，同時HepG2細(xì)胞的細(xì)胞存活率呈現(xiàn)明顯下調(diào)變化。根據(jù)細(xì)胞半數(shù)存活率的數(shù)值范圍，最終選擇最佳作用時間1-2d作為后續(xù)實驗條件。通過細(xì)胞計數(shù)法，結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞的增殖受黃芪蛋白的直接影響，增殖抑制作用呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。其中與空白對照組相比，黃芪蛋白高濃度100μg/mL組細(xì)胞具有顯著性差異（P<0.01），結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。對照10μg/mL50μg/mL100μg/mL圖3HepG2細(xì)胞結(jié)晶紫染色與生長曲線圖（HepG2細(xì)胞經(jīng)黃芪蛋白處理24h.n=3.x±s.與空白組相比*P<0.05,**P<0.01）3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測黃芪蛋白處理后HepG2細(xì)胞死亡數(shù)增多流式細(xì)胞儀檢測HepG2細(xì)胞的凋亡和壞死。對流式結(jié)果的細(xì)胞凋亡圖片進(jìn)行分析，將圖片分為四個象限：其中左下角（LL）象限代表正常細(xì)胞；左上角（UL）象限代表細(xì)胞碎片；右下角（LR）象限代表HepG2早期凋亡細(xì)胞；右上角（UR）象限代表晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞。凋亡數(shù)值表示為：除LL象限，其余三象限數(shù)值總和。通過圖4可以看出，隨著黃芪蛋白處理濃度的升高（0、10、50、100μg/mL），

山西中醫(yī)藥大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文20凋亡細(xì)胞所占總細(xì)胞比重呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，凋亡率由空白對照組的2%隨黃芪蛋白濃度逐漸上升為5%、13%和22%。由于結(jié)果中UR象限中含有壞死細(xì)胞，并不能將壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞直接分辨，凋亡結(jié)果無直接說明意義。因此，再次采用PI單染法，通過流式細(xì)胞儀，明確區(qū)分HepG2細(xì)胞發(fā)生了凋亡或者程序性死亡。不同濃度黃芪蛋白（0、10、50、100μg/mL）處理后的HepG2細(xì)胞經(jīng)過PI染色，根據(jù)儀器操作，調(diào)試儀器將活細(xì)胞控制在LR象限中，而壞死細(xì)胞則分布在UR象限。根據(jù)圖5流式圖結(jié)果發(fā)現(xiàn)：壞死細(xì)胞隨著黃芪蛋白濃度的增加而增多，得到HepG2細(xì)胞壞死率分別為（4.51±0.195）%、（7.39±0.27）%、（11.59±0.09）%、(18.78±0.34）%。結(jié)果可由此分析，與空白對照組相比，黃芪蛋白10μg/mL低濃度組的結(jié)果具有顯著性差異（P<0.05），黃芪蛋白100μg/mL高濃度組的結(jié)果具有極顯著差異（P<0.01）。說明黃芪蛋白致使肝癌細(xì)胞死亡，可能是通過使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，由此導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的增殖受到抑制，而具體緣由需進(jìn)一步探究。ABCD(注：A:0μg/mL;B:10μg/mL;C:50μg/mL;D:100μg/mL.）圖4細(xì)胞凋亡流式結(jié)果（HepG2細(xì)胞經(jīng)黃芪蛋白處理24h.n=3.x±s.與空白組相比*P<0.05,**P<0.01）

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本文編號：3103983