本文關(guān)鍵詞：TNF-α促進(jìn)B7-H1介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的適應(yīng)性免疫抵抗　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的肝癌(Hepatocellular carcinoma)是僅次于肺癌的世界第二大致死性癌癥,成為危害人類健康的主要疾病之一。肝細(xì)胞肝癌是一種典型的炎癥相關(guān)性腫瘤,通常由慢性的肝炎患者發(fā)展而來,慢性炎癥的炎癥微環(huán)境與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。陳列平教授提出腫瘤免疫逃逸的"適應(yīng)性抵抗假說",假說指出,腫瘤細(xì)胞針對(duì)免疫反應(yīng),產(chǎn)生了一個(gè)適應(yīng)自身生存的微環(huán)境。腫瘤的產(chǎn)生是幾年甚至數(shù)十年的漫長(zhǎng)過程,或許腫瘤組織已經(jīng)將微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)改造為適應(yīng)于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。腫瘤組織浸潤的T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子例如,IFN-γ,IFN-γ作用于免疫細(xì)胞可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性,從而殺傷腫瘤細(xì)胞,但同時(shí)IFN-γ也可以使腫瘤細(xì)胞B7-H1分子表達(dá)增加,表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的B7-H1分子與T細(xì)胞表面的受體PD-1結(jié)合,PD-1是表達(dá)在T細(xì)胞表面的一種重要的免疫抑制性蛋白,B7-H1與PD-1結(jié)合可以抑制T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生,導(dǎo)致T細(xì)胞功能的耗竭,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。隨著免疫療法的不斷發(fā)展進(jìn)步,特別是近幾年免疫檢查點(diǎn)療法的迅速發(fā)展,人類對(duì)于腫瘤的治療取得了很大進(jìn)步。最新一代的免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過阻斷淋巴細(xì)胞上PD1與抗原呈遞細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞上的B7-H1分子的相互作用而發(fā)揮治療效果。FDA已經(jīng)批準(zhǔn)B7-H1藥物應(yīng)用于臨床治療非小細(xì)胞肺癌和膀胱癌,其余適應(yīng)癥正在臨床實(shí)驗(yàn)階段。腫瘤微環(huán)境(Tumor Microenviroment,TME)是腫瘤細(xì)胞賴以生存的復(fù)雜環(huán)境,主要由多種細(xì)胞和蛋白質(zhì)組成,不僅起支架作用還含有大量的細(xì)胞因子。B7-H1的表達(dá)受多種細(xì)胞因子的影響,例如IFN-γ、TNF-α、IL-4和VEGF等,在肝癌的腫瘤微環(huán)境中含有大量的細(xì)胞因子,IFN-γ和TNF-α是其中兩種最主要的細(xì)胞因子。那么,我們推測(cè)在腫瘤微環(huán)境中IFN-γ是否能引起肝癌細(xì)胞B7-H1分子的表達(dá)?TNF-α是否能引起肝癌細(xì)胞B7-H1分子的升高?二者在促進(jìn)B7-H1升高中有怎樣的聯(lián)系?以及表達(dá)增加的B7-H1分子是否具有免疫抵抗功能?針對(duì)上述問題我們進(jìn)行了如下研究,本課題首先研究了 IFN-γ可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子,以及主要通過的信號(hào)通路是JAK/STAT1信號(hào)通路。并且發(fā)現(xiàn)TNF-α與IFN-γ可以協(xié)同促進(jìn)B7-H1分子的表達(dá)。進(jìn)一步研究協(xié)同促進(jìn)作用的機(jī)制,研究發(fā)現(xiàn)TNF-α通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)IFNGR1、IFNGR2的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)IFN-γ信號(hào)通路的活化,導(dǎo)致肝癌細(xì)胞B7-H1分子的表達(dá)增加。為了進(jìn)一步研究TNF-α和IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)的B7-H1分子是否具有免疫抵抗功能,我們進(jìn)行了 T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明協(xié)同誘導(dǎo)的B7-H1分子能抑制T細(xì)胞的增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。所以TNF-α和IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)的B7-H1分子具有免疫抵抗作用。方法一、IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子(一)B7-H1分子的表達(dá)對(duì)于IFN-γ有濃度和時(shí)間的依賴性肝癌細(xì)胞SMMC-7721種板貼壁后,采用不同濃度的IFN-γ誘導(dǎo)B7-H1的表達(dá),將儲(chǔ)存液濃度為100ng/μl的IFN-γ進(jìn)行稀釋,使其作用濃度分別為100ng/ml、50 ng/ml、20 ng/ml、10 ng/ml,誘導(dǎo)細(xì)胞 24h 后收 RNA,RT-PCR 檢測(cè) B7-H1 RNA水平的表達(dá)情況。進(jìn)一步檢測(cè)在相同濃度的IFN-γ(50 ng/ml)誘導(dǎo)下,B7-H1表達(dá)隨時(shí)間的變化,分別誘導(dǎo)0、1、2、3、6、12、24h采用RT-PCR以及qPCR的方法檢測(cè)B7-H1分子的表達(dá)情況。(二)IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子在RNA以及蛋白水平的表達(dá)本實(shí)驗(yàn)所用的肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HLE-7402、HuH-7和Hep3B均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,這四種肝癌細(xì)胞均在50 ng/ml IFN-γ誘導(dǎo)6h的條件下采用RT-PCR方法檢測(cè)B7-H1 RNA水平的表達(dá)。我們選擇其中兩種細(xì)胞系SMMC-7721和HuH-7進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),在50 ng/ml IFN-γ誘導(dǎo)6h的條件下用qPCR方法進(jìn)一步檢測(cè)B7-H1 RNA水平的表達(dá)。采用50ng/ml IFN-γ誘導(dǎo)24h后,用PBS清洗一次去除死亡細(xì)胞,再用胰酶將細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞,清洗去除胰酶,再標(biāo)記人B7-H1的流式抗體,同時(shí)采用同型抗體去除非特異性著色,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)B7-H1蛋白水平的表達(dá)。二、IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子表達(dá)主要通過的信號(hào)通路首先檢測(cè)IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子涉及的信號(hào)通路。將SMMC-7721細(xì)胞種板貼壁后再加入IFN-γ(50ng/ml),分別誘導(dǎo)0、5、15、30、60min,Western-blot 方法檢測(cè) p-STAT1、p-AKT、p-P65、p-P38、p-MEK 和 p-JNK的活化情況。根據(jù)檢測(cè)到的IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子涉及的信號(hào)通路購買信號(hào)通路的抑制劑。Western-blot方法顯示涉及的信號(hào)通路有NF-κB、PI3K、MEK、JNK、P38、JAK/STAT1。首先采用Western-blot方法檢測(cè)各種抑制劑(BAY11-7082(NF-κB)、LY294002(PI3Kα/δ/β)、U0126(MEK1/2),、SP600125(JNK1/2/3)、SB202190(p38α/β)、Ruxolitinib(JAK1/2))對(duì)于對(duì)應(yīng)信號(hào)通路的抑制效果以及最適抑制濃度。將SMMC-7721細(xì)胞種板貼壁后,提前采用最適濃度抑制劑處理1h,再加入IFN-γ(50ng/ml)同時(shí)含有新抑制劑,37℃,培養(yǎng)15min,加入蛋白裂解液收細(xì)胞蛋白,采用Western-blot的方法檢測(cè)最適抑制劑濃度。檢測(cè)IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子主要通過的信號(hào)通路。將SMMC-7721細(xì)胞種板貼壁后,提前運(yùn)用最適濃度的抑制劑處理1h,再加入IFN-γ(50ng/ml)同時(shí)含有新抑制劑,37℃,誘導(dǎo)細(xì)胞6h用qPCR方法檢測(cè)B7-H1的表達(dá)情況。進(jìn)一步采用小干擾確證IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子表達(dá)主要通過JAK/STAT1信號(hào)通路。所以合成JAK/STAT1信號(hào)通路中兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子STAT1和IRF1的小干擾。首先驗(yàn)證小干擾的干擾效果,SMMC-7721細(xì)胞種板貼壁,第二天大約生長(zhǎng)至70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24h后收RNA,RT-PCR的方法檢測(cè)STAT1和IRF1的表達(dá)水平,選擇干擾效果好的進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SMMC-7721細(xì)胞種板轉(zhuǎn)染STAT1和IRF1小干擾,24h后加IFN-γ(50 ng/ml)誘導(dǎo)細(xì)胞6h,qPCR檢測(cè)B7-H1 RNA水平的變化。三、TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子SMMC-7721 或 HuH-7 細(xì)胞種板貼壁后,分別用 TNF-α(50ng/ml)、IFN-γ(5ng/ml)或者二者同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞,6h后收RNA,采用qPCR方法檢測(cè)在RNA水平B7-H1分子的表達(dá)變化情況。誘導(dǎo)24h后采用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)蛋白水平的變化。四、TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子的機(jī)制(一)分析TNF-α對(duì)于IFN-γ信號(hào)通路的作用運(yùn)用各種信號(hào)通路的抑制劑檢測(cè)TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)B7-H1表達(dá)過程中信號(hào)通路的變化。先將SMMC-7721細(xì)胞或HuH-7細(xì)胞種板貼壁后用抑制劑處理,37℃,1h,抑制信號(hào)通路的活性,再用TNF-α(50ng/ml)和IFN-γ(5ng/ml)同時(shí)含有抑制劑的培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞,6h后收細(xì)胞的RNA,運(yùn)用qPCR方法檢測(cè)B7-H1分子的表達(dá)變化情況。為了進(jìn)一步驗(yàn)證信號(hào)通路的變化,我們運(yùn)用信號(hào)通路的小干擾RNA,siSTAT1、siIRF1、siP65、sic-JUN、sic-FOS 和 siATF2,12 孔板,轉(zhuǎn)染小干擾RNA24h 后加 TNF-α(50ng/ml)和IFN-γ(5ng/ml)誘導(dǎo)細(xì)胞,6h 后收 RNA,運(yùn)用qPCR方法檢測(cè)B7-H1分子的變化情況。將種板貼壁后的細(xì)胞用TNF-α(50ng/ml)和IFN-γ(5ng/ml)培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子,24h后收細(xì)胞蛋白,用Western-blot方法檢測(cè)蛋白水平JAK/STAT1信號(hào)通路中JAK2以及p-JAK2、STAT1以及p-STAT1的變化情況。(二)TNF-α對(duì)于IFNGR1、IFNGR2表達(dá)的影響檢測(cè)JAK/STAT1信號(hào)通路上游分子IFNGR1、IFNGR2的變化情況。將種板貼壁后的細(xì)胞分別用TNF-α(50ng/ml)、IFN-γ(5ng/ml)或者二者同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子,6h后收細(xì)胞的RNA,qPCR的方法檢測(cè)IFNGR1、IFNGR2表達(dá)的變化。為了進(jìn)一步研究TNF-α增強(qiáng)IFNGR1、IFNGR2表達(dá)的機(jī)制。首先查閱文獻(xiàn)TNF-α主要的信號(hào)通路有NF-κB、MEK、P38、JNK等,運(yùn)用這些信號(hào)通路的抑制劑抑制細(xì)胞,將SMMC-7721細(xì)胞或HuH-7細(xì)胞種板貼壁后提前1h加抑制劑處理(5μM BAY11-7082(NF-κB)、5μM U0126(MEK1/2)、5μM SB202190(p38α/β)、5μM SP600125(JNK1/2/3)),再運(yùn)用 TNF-α(50ng/ml)誘導(dǎo) 6h,qPCR 的方法檢測(cè)IFNGR1、IFNGR2表達(dá)的變化。為了進(jìn)一步確證TNF-α是通過NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)IFNGR1、IFNGR2的表達(dá),運(yùn)用小干擾試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。將SMMC-7721細(xì)胞或HuH-7細(xì)胞種板貼壁后轉(zhuǎn)染 siP65,24h 后再用 TNF-α(50ng/ml)誘導(dǎo) 6h,qPCR 的方法檢測(cè) IFNGR1、IFNGR2表達(dá)的變化。五、TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)的B7-H1分子具有免疫抵抗功能為了驗(yàn)證TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)的B7-H1分子是否具有免疫抵抗功能,我們進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。(一)小鼠腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)1.TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)小鼠肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6貼壁后,采用IFN-γ、TNF-α或者IFN-γ和TNF-α同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子,誘導(dǎo)6h后,收細(xì)胞RNA,qPCR方法檢測(cè)Hepa1-6細(xì)胞表面B7-H1分子RNA水平表達(dá)的變化情況。細(xì)胞因子誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞24h,用PBS清洗一次去除死亡細(xì)胞,再用胰酶將細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞,清洗去除胰酶,標(biāo)記小鼠B7-H1流式抗體,檢測(cè)B7-H1蛋白水平的變化。2.腫瘤細(xì)胞種板和轉(zhuǎn)染合成小鼠B7-H1的小干擾,首先檢測(cè)小干擾的效果。Hepa1-6細(xì)胞種板,12孔板,每孔1.8×105個(gè)細(xì)胞,第二天細(xì)胞生長(zhǎng)至70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染小鼠B7-H1小干擾。轉(zhuǎn)染24h,qPCR檢測(cè)RNA水平的變化。轉(zhuǎn)染48h,Western-blot檢測(cè)蛋白水平的變化。第一天下午小鼠Hepa1-6種板,12孔板每孔1.8×105個(gè)。第二天上午生長(zhǎng)至70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染小鼠B7-H1。3.腫瘤細(xì)胞用IFN-γ和TNF-α處理IFN-γ儲(chǔ)存濃度為50ng/μl,作用濃度為5ng/ml,取2μl儲(chǔ)存液溶于18μl的T細(xì)胞培養(yǎng)基中,稀釋后濃度為5ng/μl,則每1ml培養(yǎng)基中加1μl IFN-γ稀釋液。TNF-α儲(chǔ)存濃度為100ng/μl,作用濃度為50ng/ml,取8μl儲(chǔ)存液溶于72μl的T細(xì)胞培養(yǎng)基中,稀釋后濃度為10ng/μl,則每1ml培養(yǎng)基中加5μl TNF-α稀釋液。上述Hepa1-6細(xì)胞種板轉(zhuǎn),6h換液同時(shí)加IFN-γ和TNF-α處理。4.將腫瘤細(xì)胞用mitomycinC處理第三天上午,將腫瘤細(xì)胞用mitomycinC處理,mitomycinC粉末5mg,加747.65μl DMSO稀釋后濃度為20mM,即6.687μg/μl。設(shè)置濃度梯度確定最適宜mitomycinC處理的作用濃度,將最適濃度的mitomycinC加入上述轉(zhuǎn)染且已用IFN-γ和TNF-α處理的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)板中,靜置37℃,30min,清洗三次去除殘留的 mitomycinC。5.取小鼠單個(gè)核細(xì)胞第三天上午取SPF級(jí)的6-8W周C57BL/6J小鼠,脫頸處死置于75%酒精中浸泡5min,超凈工作臺(tái)中取小鼠脾臟組織,取出后在PBS中清洗2遍。置于70μM的過濾器上先用剪刀剪碎再用5ml針?biāo)ㄑ心?細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到10ml離心管中,離心1000rpm,5min,用3ml Tris-NH4Cl重懸沉淀裂解紅細(xì)胞,靜置3min。加5ml培養(yǎng)基阻止裂紅,1000rpm,5min。用2mlT細(xì)胞培養(yǎng)基重懸,取1ml溶于9ml中進(jìn)行10倍稀釋,計(jì)數(shù)。6.CFSE染色CFSE每管粉末50μg,分子量為557.47,每管加18ulDMSO,則懸液的濃度為5mM。設(shè)置濃度梯度選擇較好的CFSE作用濃度。12孔板每孔需單個(gè)核細(xì)胞1.6×106個(gè),按所需的細(xì)胞數(shù)計(jì)算所需T細(xì)胞懸液的量,離心,1000r/min,5min。用最適濃度的CFSE溶液重懸細(xì)胞,室溫靜置7min,加5倍體積含有血清的培養(yǎng)基冰上靜置5min。用大量含血清培養(yǎng)基清洗三次,最后用T細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。設(shè)置濃度梯度選擇適宜的ConA作用濃度,根據(jù)每孔需要T細(xì)胞、IFN-γ、TNF-α以及ConA配成細(xì)胞懸液,加入到用mitomycinC處理的腫瘤細(xì)胞孔中進(jìn)行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)第二天,每孔各加1ml T細(xì)胞培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中是否需要IFN-γ、TNF-α以及ConA都與前述孔中液體相同。7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)72h,采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖情況。將12孔板中的細(xì)胞懸液加入到對(duì)應(yīng)流式管中,用PBS清洗一次將清洗的PBS也加入到對(duì)應(yīng)管中。用胰酶消化殘留細(xì)胞,將細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的流式管中,1000r/min,5min。用50μl含0.5%血清的PBS重懸。標(biāo)記CD3抗體4℃,45min。每管加3ml含0.5%血清的PBS清洗一次,1000r/min,5min。用300μl含0.5%血清的PBS重懸,用400目銅網(wǎng)進(jìn)行過濾,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B7-H1分子在蛋白水平表達(dá)的情況。(二)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.小鼠肝癌細(xì)胞系的準(zhǔn)備選擇狀態(tài)較好的小鼠肝癌細(xì)胞hepa1-6,將hepa1-6細(xì)胞大量擴(kuò)增。2.皮下成瘤將瓶中的細(xì)胞用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞,調(diào)整濃度大約4×106個(gè)/ml,選擇SPF級(jí)的6-8W周C57BL/6J小鼠,每只小鼠腹部皮下注射100μl細(xì)胞懸液,觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。根據(jù)腫瘤大小將小鼠平均分為3組,A組注射siNC,B組注射siNC、IFN-γ和 TNF-α,C 組注射 siB7-H1、IFN-γ 和 TNF-α。3.注射小干擾RNA和細(xì)胞因子第一天將粉末小干擾RNA用DEPC水溶解,每只小鼠大約10μg siRNA。運(yùn)用專用體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑polyplus in vivo-jetPEI進(jìn)行瘤內(nèi)注射。第二天瘤內(nèi)注射細(xì)胞因子TNF-α0.5μg/只,IFN-γ0.05μg/只,小干擾和細(xì)胞因子每三天注射一次,小干擾和細(xì)胞因子共注射四次。4.腫瘤體積的測(cè)量第三天測(cè)量腫瘤體積,整個(gè)過程腫瘤體積測(cè)量六次。結(jié)果一、IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子為了檢測(cè)IFN-γ是否能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系B7-H1分子的表達(dá),運(yùn)用肝癌細(xì)胞系SMMC-7721在不同濃度IFN-γ誘導(dǎo)條件下檢測(cè)B7-H1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在采用不同濃度IFN-γ誘導(dǎo)條件下所表達(dá)的B7-H1分子的強(qiáng)度不同,隨著IFN-γ濃度增加B7-H1分子的表達(dá)量增加,但是IFN-γ到達(dá)一定濃度時(shí)B7-H1分子的表達(dá)強(qiáng)度不再增加,同時(shí)結(jié)果顯示50ng/ml的IFN-γ是引起B(yǎng)7-H1表達(dá)的最適濃度。相同濃度的IFN-γ(50ng/ml)誘導(dǎo)不同時(shí)間所表達(dá)的B7-H1分子的強(qiáng)度也不同,在0-6h隨著時(shí)間延長(zhǎng)B7-H1分子的表達(dá)量增強(qiáng),6h之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)B7-H1分子的表達(dá)降低。為了進(jìn)一步確認(rèn)上述現(xiàn)象,我們又在另外幾種肝癌細(xì)胞SMMC-7721、HLE-7402、HuH-7、Hep3B中進(jìn)行了上述實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示IFN-γ均可以誘導(dǎo)上述幾種肝癌細(xì)胞B7-H1分子在RNA水平的表達(dá)。又進(jìn)一步運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)IFN-γ是否可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子在蛋白水平的表達(dá),結(jié)果顯示在SMMC-7721和HuH-7細(xì)胞中,IFN-γ均可以誘導(dǎo)B7-H1分子在蛋白水平的表達(dá)二、IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1的表達(dá)主要通過JAK/STAT1信號(hào)通路。用Western-blot方法檢測(cè)到IFN-γ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子涉及多種信號(hào)通路。進(jìn)一步用Western-blot方法檢測(cè)各種抑制劑的最適抑制濃度,在IFN-γ誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上運(yùn)用最適濃度的抑制劑,結(jié)果顯示多條信號(hào)通路對(duì)于IFN-γ誘導(dǎo)的B7-H1的表達(dá)都有影響,但起主要作用的是JAK/STAT1信號(hào)通路。轉(zhuǎn)染JAK/STAT1信號(hào)通路中主要的轉(zhuǎn)錄因子STAT1和IRF1的小干擾后,再用IFN-γ誘導(dǎo),結(jié)果顯示B7-H1的表達(dá)明顯降低,驗(yàn)證了上述結(jié)論JAK/STAT1信號(hào)通路在這個(gè)過程中起主要作用。三、TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子的表達(dá)在SMMC-7721細(xì)胞和HuH-7細(xì)胞中采用TNF-α、IFN-γ或者二者同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子,研究發(fā)現(xiàn),二者同時(shí)誘導(dǎo)比單用TNF-α或者IFN-γ時(shí)B7-H1分子在RNA水平以及蛋白水平的表達(dá)都有明顯升高。所以,TNF-α和IFN-γ在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1表達(dá)過程中二者具有明顯的協(xié)同促進(jìn)作用。四、TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子的機(jī)制為了研究二者協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子過程中主要的信號(hào)通路,運(yùn)用抑制劑抑制信號(hào)通路的活化,同時(shí)運(yùn)用TNF-α、IFN-γ誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子。結(jié)果顯示,在二者協(xié)調(diào)誘導(dǎo)B7-H1分子表達(dá)過程中起主要作用的信號(hào)通路還是JAK/STAT1信號(hào)通路。為了進(jìn)一步驗(yàn)證JAK/STAT1信號(hào)通路的作用,運(yùn)用信號(hào)通路的小干擾RNA,發(fā)現(xiàn)運(yùn)用siSTAT1、siIRF1的小干擾后B7-H1下降較明顯與抑制劑的效果一致。進(jìn)一步檢測(cè)JAK/STAT1信號(hào)通路蛋白水平的變化,發(fā)現(xiàn)在蛋白水平JAK2、STAT1磷酸化水平增加,即這條信號(hào)通路的活化增強(qiáng)。又檢測(cè)這條信號(hào)通路的上游分子IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)情況,qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNF-α均能使IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)增加。為了進(jìn)一步探討TNF-α怎樣增強(qiáng)IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)。與前述相同運(yùn)用信號(hào)通路的抑制劑以及小干擾RNA,檢測(cè)在只用TNF-α刺激時(shí)IFNGR1、IFNGR2的變化,結(jié)果顯示運(yùn)用NF-κB的抑制劑以及小干擾RNA之后,IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)明顯降低。即TNF-α通過NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)IFNGR1、IFNGR2的表達(dá)。五、TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)的B7-H1分子具有免疫抵抗作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6可以被TNF-α、IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)B7-H1分子,而且TNF-α和IFN-γ對(duì)于B7-H1的表達(dá)具有協(xié)同促進(jìn)作用。將小鼠的腫瘤細(xì)胞用TNF-α和IFN-γ處理使B7-H1分子表達(dá)增加,再將腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng),與未用TNF-α和IFN-γ處理的對(duì)照組相比,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CD3+的細(xì)胞中CFSE的平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng),即T細(xì)胞的增殖減弱,所以T細(xì)胞的增殖受到抑制。將小鼠的腫瘤細(xì)胞運(yùn)用B7-H1的小干擾處理,再用TNF-α、IFN-γ誘導(dǎo),流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CD3+的細(xì)胞中CFSE的平均熒光強(qiáng)度降低,T細(xì)胞增殖基本與對(duì)照組一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)的B7-H1分子能抑制T細(xì)胞的增殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,A組注射NC小干擾,B組注射NC小干擾并且注射TNF-α和IFN-γ,C組注射B7-H1小干擾并且注射TNF-α和IFN-γ,所以B組B7-H1的表達(dá)最強(qiáng),六次腫瘤體積測(cè)量的統(tǒng)計(jì)圖顯示,B組腫瘤體積比A、C組大,并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)表達(dá)的B7-H1分子具有功能,能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。結(jié)論一、IFN-γ主要通過JAK/STAT1信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子的表達(dá)二、TNF-α與IFN--γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞B7-H1分子的表達(dá)三、TNF-α通過NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)IFNGR1、IFNGR2的表達(dá),促進(jìn)IFN-γ信號(hào)通路的活化四、TNF-α與IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)的B7-H1分子具有免疫抵抗作用
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1328603