本文關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA遺傳變異與乳腺癌易感性關(guān)聯(lián)研究

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【摘要】：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,嚴重威脅全球女性健康。據(jù)統(tǒng)計,2012年女性新發(fā)乳腺癌逾167萬例,占所有新發(fā)惡性腫瘤的25.1%;由乳腺癌導(dǎo)致的死亡逾52萬例,占所有惡性腫瘤引起死亡的14.7%。在我國,乳腺癌發(fā)病率以每年3-5%的速度遞增,并且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢。乳腺癌的發(fā)病機制較為復(fù)雜,目前普遍認為是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果。相同的環(huán)境危險因素暴露下僅部分個體最終發(fā)生乳腺癌,提示遺傳背景差異可能導(dǎo)致不同個體乳腺癌易感性不同。因此,鑒定遺傳標志物以篩選具有遺傳易感性的乳腺癌高危人群,進而采取針對性的預(yù)防措施,對降低乳腺癌發(fā)病率和死亡率具有重要意義。新近研究已證實長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)的異常表達參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,特定lncRNA可能作為腫瘤診斷的標志物和潛在的藥物靶點。LncRNA主要是通過與目標基因或特定蛋白的結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控功能,基因組上lncRNA序列遺傳變異可能改變lncRNA自身的表達水平或影響其與目標序列/蛋白的結(jié)合,繼而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此,本課題擬首先對乳腺癌癌和癌旁組織RNA進行全轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing,RNA-seq)以系統(tǒng)篩選異常表達的lncRNA,進而分析lncRNA上遺傳變異與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)。本課題研究設(shè)計包含兩部分內(nèi)容:(1)測序篩選階段,采用illumina公司二代測序平臺Hiseq 1500,針對5例乳腺癌新發(fā)患者的癌和癌旁組織RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序。應(yīng)用FastQC軟件對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制,利用Bowtie/Tophat軟件對序列進行拼接,通過Tophat(v2.0.9)軟件將所得序列定位于人類基因組數(shù)據(jù)庫(hg19)上,注釋之后挑選出轉(zhuǎn)錄本長度大于200bp以上非編碼RNA,再通過Cufflinks(v2.2.1)評價表達水平。應(yīng)用R軟件DESeq2包進行差異表達分析,篩選顯著差異表達的lncRNA。(2)關(guān)聯(lián)研究階段,采用病例對照研究,納入1486例醫(yī)院來源的新發(fā)乳腺癌患者,1519健康對照來自參加江蘇省城鄉(xiāng)慢性非傳染性疾病調(diào)查的人群,按年齡和居住地區(qū)(城鄉(xiāng)比例)等分布特征與病例頻數(shù)匹配。通過RegulomDB進行生物信息學(xué)預(yù)測,篩選lncRNA區(qū)域及其上下游2kb范圍內(nèi)所有功能性遺傳變異,納入標準:RegulomeDB評分1-3;中國漢族人群中最小等位基因頻率(MAF)≥0.05;排除在中國人群中高連鎖不平衡(LD)的遺傳變異(r20.8,優(yōu)先納入評分高的位點,如果評分一致,隨機選取)。利用Sequenom公司的MassARRAY分子量陣列技術(shù)平臺對上述功能性遺傳變異進行基因分型。應(yīng)用Logistic回歸模型在各遺傳模型下計算遺傳變異的關(guān)聯(lián)P值、比值比(odds ratio,OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)。測序篩選階段共發(fā)現(xiàn)11個差異表達lncRNA位于常染色體區(qū)域、錯誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate,FDR)校正P值≤ 0.05且對數(shù)轉(zhuǎn)換的表達差值(log2fold change)≥ 2。關(guān)聯(lián)研究階段納入27個潛在功能性遺傳變異,去除4個引物設(shè)計失敗和3個基因分型率低于95%,最終獲得20個位點的分型結(jié)果。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),位于lncRNAAC104135.3上遺傳變異rs11471161的TT等位基因與降低的乳腺癌風(fēng)險顯著相關(guān)(相加模型:OR=0.86,95%CI=0.78-0.96,P=7 × 10-3);而位于lncRNA RP1-1060J15.4上遺傳變異 rs3751232 的 A 等位基因與升高的乳腺癌風(fēng)險顯著相關(guān)(相加模型:OR= 1.26,95%CI= 1.10-1.45,P=1× 10-3);在校正了年齡、初潮年齡和絕經(jīng)狀態(tài)之后,rs11471161和rs3751232仍然與乳腺癌風(fēng)險相關(guān)(rs1 1471161,OR = 0.84,95%CI = 0.74-0.94,P=4 ×10-3;rs3751232,OR =1.20,95%CI= 1.02-1.40,P= 2.7 ×10-2)。分層分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),rs1 1471161在較低初潮年齡、較低首胎活產(chǎn)年齡、絕經(jīng)前和TNM中晚期乳腺癌患者中與降低的乳腺癌風(fēng)險顯著相關(guān)(P值分別為0.012,0.023,0.042和0.026),且rs11471161只在雌激素受體(ER)陽性、孕激素受體(PR)陽性和人類表皮生長因子受體2(HER2)陰性的腫瘤亞組中表現(xiàn)為保護的效應(yīng)(P值分別為0.006,0.018和0.008);rs3751232則與ER+和PR+腫瘤亞組顯著增加的乳腺癌風(fēng)險有關(guān)(P值分別為0.004和0.036)。但是遺傳變異與乳腺癌的關(guān)聯(lián)在不同的亞組間皆不存在異質(zhì)性(異質(zhì)性檢驗P0.05)。此外,共表達分析發(fā)現(xiàn)AC104135.3與乳腺癌相關(guān)的基因ERBB2有顯著的共表達相關(guān)(r = 0.99,FDR 校正P=0.0149)。本課題通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)建立乳腺癌lncRNA表達譜,并發(fā)現(xiàn)差異表達lncRNA AC10135.3和RP11-1060J15.4 相關(guān)遺傳變異 rs11471161 和 rs3751232與乳腺癌易感性顯著關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果為乳腺癌高危人群的篩查提供了理論依據(jù)和技術(shù)指標。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：1301903