本文關(guān)鍵詞：小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因?qū)囫R豆素合成影響的研究

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【摘要】：小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌體內(nèi)可合成苦馬豆素,苦馬豆素是有毒生物堿,牲畜采食含苦馬豆素的小花棘豆植物后,體內(nèi)積累到一定程度導(dǎo)致中毒�？囫R豆素是次級(jí)代謝產(chǎn)物,其合成途徑復(fù)雜,目前該內(nèi)生真菌苦馬豆素的生物合成途徑未知。本研究首次以小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌野生株及其突變株為研究對(duì)象,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)該內(nèi)生真菌中酵母氨酸還原酶基因的表達(dá)。用酶分析法對(duì)野生株和突變株內(nèi)苦馬豆素進(jìn)行檢測(cè),還用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)野生株和突變株內(nèi)酵母氨酸和賴氨酸進(jìn)行了檢測(cè)分析。并在培養(yǎng)基中添加L-α-氨基己二酸、L-賴氨酸及L-吡啶羧酸等化合物,研究野生株和突變株中苦馬豆素及代謝相關(guān)化合物酵母氨酸、賴氨酸的變化。用生物信息學(xué)軟件分析小花棘豆內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶的cDNA序列結(jié)構(gòu),推導(dǎo)氨基酸的序列,分析肽鏈氨基酸的組成、結(jié)構(gòu)及性質(zhì),預(yù)測(cè)內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶疏水性和親水性、跨膜區(qū)域、信號(hào)肽,二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等特征,比較分析11個(gè)不同物種真菌中的酵母氨酸還原酶氨基酸序列,構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。主要研究結(jié)果如下：1.利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)野生菌株和突變菌株,轉(zhuǎn)錄水平上在野生株中檢測(cè)到酵母氨酸還原酶基因的表達(dá)；而在突變株中未檢測(cè)到酵母氨酸還原酶基因的表達(dá),但檢測(cè)到選擇標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph)基因的表達(dá)。2.利用α-甘露糖苷酶分析法檢測(cè)內(nèi)生真菌中苦馬豆素的含量,PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的野生株苦馬豆素含量高于突變株的,當(dāng)向野生株和突變株的培養(yǎng)基內(nèi)添加L-α-氨基已二酸、L-賴氨酸及L-吡啶羧酸時(shí)促進(jìn)了苦馬豆素合成,隨化合物添加濃度不同,苦馬豆素合成增長(zhǎng)量不同。3.利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)小花棘豆內(nèi)生真菌中苦馬豆素合成的前體酵母氨酸和賴氨酸進(jìn)行檢測(cè),突變株內(nèi)酵母氨酸的含量比野生菌株的低,而賴氨酸的含量變化不明顯。培養(yǎng)基內(nèi)添加α-氨基己二酸時(shí),野生株的酵母氨酸含量隨添加濃度增加而降低,而賴氨酸含量無(wú)明顯變化；突變株內(nèi)酵母氨酸和賴氨酸含量在添加濃度為1×10-4mol/L時(shí)最高,各達(dá)到0.171μg/g和0.563μg/g。4.根據(jù)小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶cDNA的序列推導(dǎo)出的多肽含472個(gè)氨基酸,其中酸性氨基酸61個(gè),堿性氨基酸57個(gè),極性氨基酸111個(gè),非極性氨基酸167個(gè)。該酶為無(wú)信號(hào)肽、無(wú)跨膜域的可溶性蛋白,其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以隨機(jī)卷曲為主,部分區(qū)域無(wú)序化。將該氨基酸序列與10個(gè)其它真菌的酵母氨酸還原酶的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析,構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
【關(guān)鍵詞】：小花棘豆 Embellisia內(nèi)生真菌 缺失突變株 苦馬豆素 酵母氨酸還原酶基因
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 1 引言10-23
• 1.1 小花棘豆內(nèi)生真菌研究10-11
• 1.2 酵母氨酸還原酶基因11-12
• 1.3 苦馬豆素12-19
• 1.3.1 苦馬豆素概述12-13
• 1.3.2 苦馬豆素分離與檢測(cè)13-15
• 1.3.3 苦馬豆素的生物合成15-19
• 1.4 賴氨酸代謝相關(guān)途徑的研究19-22
• 1.4.1 α -氨基己二酸合成途徑19-21
• 1.4.2 二氨基庚二酸合成途徑21
• 1.4.3 賴氨酸分解途徑21-22
• 1.5 研究目的及意義22-23
• 2 材料與方法23-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-26
• 2.1.1 研究材料23
• 2.1.2 試劑材料23-25
• 2.1.2.1 試劑23
• 2.1.2.2 藥品配制23-25
• 2.1.3 引物25-26
• 2.1.4 儀器設(shè)備26
• 2.2 研究方法26-33
• 2.2.1 小花棘豆內(nèi)生真菌培養(yǎng)26
• 2.2.1.1 培養(yǎng)基配制26
• 2.2.1.2 接種26
• 2.2.2 內(nèi)生真菌總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄PCR26-30
• 2.2.2.1 野生菌株和突變菌株總RNA提取26-27
• 2.2.2.2 總RNA濃度及純度檢測(cè)27
• 2.2.2.3 cDNA合成27-28
• 2.2.2.4 酵母氨酸還原酶RT-PCR檢測(cè)28-29
• 2.2.2.5 突變型菌株潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶RT-PCR檢測(cè)29-30
• 2.2.3 培養(yǎng)基內(nèi)添加化合物對(duì)野生菌株和突變菌株內(nèi)苦馬豆素合成代謝的影響30
• 2.2.3.1 添加α-氨基己二酸培養(yǎng)30
• 2.2.3.2 添加賴氨酸培養(yǎng)30
• 2.2.3.3 添加吡啶羧酸培養(yǎng)30
• 2.2.4 小花棘豆內(nèi)生真菌中苦馬豆素的提取與檢測(cè)30-31
• 2.2.4.1 苦馬豆素提取30-31
• 2.2.4.2 酶分析法檢測(cè)苦馬豆素31
• 2.2.5 小花棘豆內(nèi)生真菌中苦馬豆素合成前體化合物酵母氨酸和賴氨酸的檢測(cè)31-33
• 2.2.5.1 酵母氨酸及賴氨酸的提取31-32
• 2.2.5.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)32-33
• 3 結(jié)果與分析33-51
• 3.1 小花棘豆內(nèi)生真菌培養(yǎng)33-34
• 3.2 小花棘豆內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因研究34-37
• 3.2.1 小花棘豆內(nèi)生真菌總RNA檢測(cè)結(jié)果34-35
• 3.2.2 酵母氨酸還原酶cDNA檢測(cè)結(jié)果35-37
• 3.2.2.1 OW7.8菌株內(nèi)酵母氨酸還原酶基因表達(dá)檢測(cè)35-37
• 3.2.2.2 M1菌株內(nèi)潮霉素抗性基因表達(dá)檢測(cè)37
• 3.3 培養(yǎng)基添加不同化合物對(duì)內(nèi)生真菌苦馬豆素合成的影響37-39
• 3.3.1 培養(yǎng)基添加α-氨基己二酸培養(yǎng)的菌株內(nèi)苦馬豆素含量變化37-38
• 3.3.2 培養(yǎng)基添加L-賴氨酸培養(yǎng)的菌株內(nèi)苦馬豆素含量變化38-39
• 3.3.3 培養(yǎng)基添加L-吡啶羧酸培養(yǎng)的菌株內(nèi)苦馬豆素含量變化39
• 3.4 培養(yǎng)基添加α-氨基己二酸對(duì)內(nèi)生真菌苦馬豆素合成相關(guān)前體物影響39-43
• 3.4.1 內(nèi)生真菌中酵母氨酸含量變化39-41
• 3.4.1.1 L-酵母氨酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜39-41
• 3.4.1.2 L-酵母氨酸含量41
• 3.4.2 內(nèi)生真菌中賴氨酸含量變化41-43
• 3.4.2.1 L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜41-43
• 3.4.2.2 L-賴氨酸含量43
• 3.5 酵母氨酸還原酶氨基酸序列的生物信息學(xué)分析43-51
• 3.5.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)43-44
• 3.5.2 信號(hào)肽預(yù)測(cè)44
• 3.5.3 疏水性/親水性分析44-45
• 3.5.4 跨膜區(qū)域分析45-46
• 3.5.5 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)46-49
• 3.5.6 二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析49-50
• 3.5.7 固有無(wú)序化特征預(yù)測(cè)分析50-51
• 4 討論與結(jié)論51-54
• 4.1 討論51-52
• 4.1.1 小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因51
• 4.1.2 培養(yǎng)條件對(duì)菌株內(nèi)苦馬豆素合成的影響51-52
• 4.1.3 酵母氨酸還原酶生物信息學(xué)分析52
• 4.2 結(jié)論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-61
• 附錄161-63
• 附錄263-64
• 致謝64-65
• 作者簡(jiǎn)介65

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 哈布拉;小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因?qū)囫R豆素合成影響的研究[D];內(nèi)蒙古師范大學(xué);2016年

2 王思遠(yuǎn);小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因的克隆及其缺失載體的構(gòu)建[D];內(nèi)蒙古師范大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：740506