玉米大斑病是世界玉米主產(chǎn)區(qū)的主要葉部病害。發(fā)病嚴(yán)重時常常造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。在中國東北、西北、華北北部和南方山區(qū)的冷涼玉米種植區(qū)該病害發(fā)生較重。本文以快速堿化因子(RALF,Rapid alkalization factor)為研究對象,對玉米大斑病菌中StRALF基因保守序列進(jìn)行了克隆,使用編碼序列末端快速克隆技術(shù)(RACE)獲得了cDNA序列全長,并對其編碼蛋白進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析,使用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)技術(shù)對其進(jìn)行了不同酸堿條件和不同侵染時期基因表達(dá)分析,結(jié)果如下:成功克隆玉米大斑病菌中StRALF基因保守序列,其長度為114 bp。通過對該基因保守序列編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,可知此段序列編碼37個氨基酸,推測分子量約為3.6 KD,理論等電點(diǎn)為7.74。經(jīng)過氨基酸同源性比對分析,其與已公布的RALF蛋白具有一定同源性,但不完全保守。利用RACE技術(shù)獲得StRALF基因的cDNA序列全長為279 bp,生物信息學(xué)分析后確定其編碼92個氨基酸,推測為分泌蛋白。此蛋白不含有螺旋區(qū)域,所以不會執(zhí)行代謝調(diào)節(jié)、識別分子、膜通道等功能。經(jīng)過氨基酸同源性分析比對,所...

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【學(xué)位級別】：碩士

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前言
第一章 玉米大斑病菌致病基因研究進(jìn)展
    1.1 玉米大斑病菌研究進(jìn)展
        1.1.1 玉米大斑病的發(fā)生與危害
        1.1.2 玉米大斑病菌的生物學(xué)研究
        1.1.3 玉米大斑病菌中致病基因的研究
    1.2 快速堿化因子(RALF)相關(guān)研究
        1.2.1 植物和真菌中的多肽激素
        1.2.2 快速堿化因子的發(fā)現(xiàn)(RALF家族)
        1.2.3 真菌中的RALF
    1.3 基因研究技術(shù)的發(fā)展
        1.3.1 基因克隆
        1.3.2 RT-qPCR技術(shù)
    1.4 獲得c DNA全長的相關(guān)研究
        1.4.1 獲得c DNA全長的方法
        1.4.2 RACE的技術(shù)原理
        1.4.3 RACE技術(shù)的發(fā)展
        1.4.4 基因研究中RACE技術(shù)的使用
    1.5 生物信息學(xué)分析
第二章 玉米大斑病菌中StRALF基因的克隆
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 試驗(yàn)菌株
        2.1.2 試驗(yàn)主要試劑
        2.1.3 試驗(yàn)主要培養(yǎng)基
        2.1.4 試驗(yàn)主要儀器
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 菌株的獲得與培養(yǎng)
        2.2.2 StRALF基因保守區(qū)克隆引物的獲得
        2.2.3 總RNA的提取
        2.2.4 StRALF基因保守區(qū)的PCR擴(kuò)增
        2.2.5 目的片段的純化回收
        2.2.6 回收產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化
        2.2.7 菌液PCR以及質(zhì)粒提取
        2.2.8 測序
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 獲得StRALF基因保守區(qū)序列
        2.3.2 StRALF基因保守區(qū)PCR結(jié)果
        2.3.3 確定克隆得到的保守區(qū)氨基酸序列
        2.3.4 克隆保守區(qū)的理化性質(zhì)
    2.4 本章小結(jié)
第三章 StRALF基因c DNA序列分析
    3.1 材料與儀器
        3.1.1 試驗(yàn)菌株
        3.1.2 試驗(yàn)試劑
        3.1.3 試驗(yàn)所需培養(yǎng)基
        3.1.4 試驗(yàn)儀器
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 總RNA的提取
        3.2.2 cDNA第一條鏈的合成
        3.2.3 3 ’RACE試驗(yàn)
        3.2.4 5 ’RACE試驗(yàn)
        3.2.5 目的片段回收
        3.2.6 測序
        3.2.7 完整開放閱讀框的測序
        3.2.8 StRALF基因完整編碼區(qū)生物信息學(xué)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 3 ’RACE PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.2 5 ’RACE PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.3 克隆及測序結(jié)果
        3.3.4 StRALF的理化性質(zhì)
        3.3.5 StRALF蛋白的親疏水性
        3.3.6 StRALF蛋白跨膜情況
        3.3.7 StRALF蛋白信號肽預(yù)測
        3.3.8 StRALF蛋白Coil區(qū)域分析
        3.3.9 StRALF蛋白同源性分析
    3.4 本章小結(jié)
第四章 StRALF基因RT-qPCR表達(dá)量分析與相關(guān)生物學(xué)特性
    4.1 材料與儀器
        4.1.1 試驗(yàn)菌株
        4.1.2 試驗(yàn)試劑
        4.1.3 試驗(yàn)所需培養(yǎng)基
        4.1.4 試驗(yàn)所需儀器與耗材
    4.2 St RALF 基因?qū)崟r熒光定量 PCR 試驗(yàn)方法
        4.2.1 不同pH值條件下的菌株培養(yǎng)與收集
        4.2.2 不同侵染時期的菌體培養(yǎng)與收集
        4.2.3 不同酸堿條件下病菌侵染寄主的菌體培養(yǎng)與收集
        4.2.4 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄
        4.2.5 實(shí)時熒光定量PCR引物選擇
        4.2.6 所需引物特異性檢測
        4.2.7 StRALF基因保守區(qū)RT-qPCR反應(yīng)體系與程序
    4.3 玉米大斑病菌堿化因子生物學(xué)特性試驗(yàn)
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 引物特異性檢測結(jié)果
        4.4.2 不同pH培養(yǎng)條件下StRALF表達(dá)量分析
        4.4.3 真菌對寄主侵染過程中StRALF表達(dá)量分析
        4.4.4 不同pH下真菌侵染寄主后StRALF表達(dá)量分析
        4.4.5 pH對試驗(yàn)菌株的生長及產(chǎn)孢量的影響
        4.4.6 不同pH值培養(yǎng)基中菌體表型觀察
        4.4.7 不同pH培養(yǎng)條件下侵染點(diǎn)的觀察
    4.5 本章小結(jié)
第五章 結(jié)論與討論
    5.1 結(jié)論
        5.1.1 StRALF基因保守區(qū)克隆結(jié)果分析
        5.1.2 StRALF基因c DNA全長獲取及相關(guān)研究
        5.1.3 StRALF基因?qū)崟r熒光定量結(jié)果與相關(guān)生物學(xué)特性
    5.2 展望與討論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表論文



本文編號：3855672