溶菌酶,又稱N-乙酰胞壁質(zhì)肽聚糖水解酶,是一種無(wú)害、無(wú)毒,不會(huì)殘留在體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)。其廣泛分布于不同生物體中,是一種能水解微生物細(xì)胞壁黏多糖的堿性水解酶。2007年,本實(shí)驗(yàn)室首次分離和鑒定了海參i-型溶菌酶基因,并已在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中高效表達(dá)其目的蛋白。該研究以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的能高效表達(dá)的海參i-型溶菌酶的畢赤酵母基因工程菌HS3-1為發(fā)酵出發(fā)菌株,運(yùn)用發(fā)酵罐對(duì)該工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵液經(jīng)過(guò)一系列分離純化后得到海參i-型溶菌酶產(chǎn)品。利用高效液相色譜和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對(duì)海參i-型溶菌酶產(chǎn)品進(jìn)行分析測(cè)定,通過(guò)利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法對(duì)該酶熱穩(wěn)定性進(jìn)一步研究。研究結(jié)果如下:（1）5 L發(fā)酵罐初始為3 L BSM基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基,發(fā)酵過(guò)程控制條件為溫度30℃,pH6.0,攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min,溶解氧DO 30%;發(fā)酵過(guò)程分為三個(gè)階段,即細(xì)胞生長(zhǎng)階段、甘油流加階段和甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)物分泌階段。發(fā)酵結(jié)束后,分析該發(fā)酵液的溶菌酶產(chǎn)量為58mg/L。最后生產(chǎn)的海參i-型溶菌酶產(chǎn)品,其酶活力為1246 U/mg。高效液相色譜分析結(jié)果顯示,該溶菌酶產(chǎn)品與蛋清溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間相同,而且無(wú)... 

【文章來(lái)源】：大連工業(yè)大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

溶菌酶的催化機(jī)制Fig.1-1Thecatalyticmechanismoflysozyme

第三章結(jié)果與討論26圖3-2中可以看出，該圖為發(fā)酵工藝參數(shù)控制圖，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中溫度和pH隨著發(fā)酵的進(jìn)行，一直維持在設(shè)定值上下浮動(dòng)，說(shuō)明其比較穩(wěn)定。在細(xì)胞生長(zhǎng)階段，因細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖需要進(jìn)行大量溶解氧，這時(shí)可以通過(guò)提高通氣量和額外補(bǔ)充氧氣的方式來(lái)維持溶氧。發(fā)酵過(guò)程中溶解氧的變化是一個(gè)十分重要的參數(shù)，它的變化可以更加精準(zhǔn)控制發(fā)酵，從而保障了整個(gè)發(fā)酵的順利進(jìn)行。圖3-2發(fā)酵工藝參數(shù)控制圖Fig.3-2Fermentationprocessparametercontrolchart3.1.2發(fā)酵過(guò)程中菌體量及酶活力檢測(cè)在發(fā)酵初始階段，測(cè)得細(xì)胞菌體濕重為61g/L。隨著發(fā)酵進(jìn)行到36h，此時(shí)細(xì)胞菌體積累量達(dá)到180-220g/L，細(xì)胞積累量達(dá)到穩(wěn)定。接著加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，開始有海參i-型溶菌酶產(chǎn)生。從圖3-3可以看出，0-26h為種子液接入發(fā)酵罐內(nèi)細(xì)胞菌體大量積累。26-36h溶解氧突升到90%以上，開始對(duì)發(fā)酵液補(bǔ)充流加甘油培養(yǎng)基，使細(xì)胞菌體量進(jìn)一步積累。36-132h在線監(jiān)測(cè)控制發(fā)酵液甲醇濃度1%左右，海參i-型溶菌酶逐漸積累，酶活力最高到達(dá)600U/mL。而132h后溶菌酶酶活力不再增加，即發(fā)酵結(jié)束。

第三章結(jié)果與討論27圖3-3酶活力及菌體濕重變化Fig.3-3Thechangesofenzymeactivityandwetcellweight3.1.3不同時(shí)期誘導(dǎo)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析對(duì)上述發(fā)酵過(guò)程各個(gè)時(shí)期進(jìn)行取樣，利用SDS-PAGE電泳分析其溶菌酶積累趨勢(shì)。從圖3-4中可以看出，1泳道為誘導(dǎo)0h時(shí)，無(wú)海參i-型溶菌酶產(chǎn)生；2泳道為誘導(dǎo)12h時(shí)，開始產(chǎn)生溶菌酶。隨著甲醇誘導(dǎo)時(shí)間的遷移，溶菌酶的表達(dá)量也隨著不斷增加，在誘導(dǎo)96h時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到了最大。進(jìn)一步將圖3-4中目蛋白表達(dá)條帶使用Bandscan軟件進(jìn)行占比分析，結(jié)果顯示誘導(dǎo)96h的目的蛋白含量在67.8%。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]簡(jiǎn)述溶菌酶的研究現(xiàn)狀[J]. 李紅,易建中,劉成倩,孫曉云,嚴(yán)華祥.  國(guó)外畜牧學(xué)(豬與禽). 2016(06)
[2]玉米葉片2種總蛋白質(zhì)提取方法的比較[J]. 齊建雙,王彥玲,鐵雙貴,盧彩霞,岳潤(rùn)清,韓小花,燕樹鋒,孫若楠.  華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2015(01)
[3]溶菌酶及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 范林林,林楠,馮敘橋,王晶晶,楊文晶,許泰百.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2015(03)
[4]熱處理對(duì)海參溶菌酶C端多肽的抑菌活性和結(jié)構(gòu)的影響[J]. 武瑤,梁雯婧,李成,商旭,叢麗娜.  高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào). 2014(05)
[5]溶菌酶在養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 李鑫,譚志堅(jiān),凌欣華,李巧賢.  獸醫(yī)導(dǎo)刊. 2014(04)
[6]溶菌酶在水產(chǎn)品防腐保鮮中的應(yīng)用[J]. 任西營(yíng),胡亞芹,胡慶蘭,楊水兵,余海霞,鄭剛,楊志堅(jiān).  食品工業(yè)科技. 2013(08)
[7]蛋清、重組溶菌酶酶學(xué)性質(zhì)及其對(duì)小鼠腸道菌群和血清生化指標(biāo)的影響[J]. 田洪源,劉明啟,戴賢君.  中國(guó)食品學(xué)報(bào). 2012(10)
[8]溶菌酶的分離純化與活性測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J]. 朱蓮蓮,江明鋒,王永.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2012(19)
[9]微生物溶菌酶酶學(xué)性質(zhì)及抑菌特性研究[J]. 費(fèi)國(guó)琴,李曉暉,寧喜斌,韓曉晨.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(09)
[10]苦瓜溶菌酶的分離純化及特性研究[J]. 常景立,汪少蕓,周建,武柯,李晶,饒平凡.  中國(guó)食品學(xué)報(bào). 2009(05)

博士論文
[1]天然無(wú)規(guī)蛋白分子力場(chǎng)的開發(fā)及應(yīng)用[D]. 葉緯.上海交通大學(xué) 2015

碩士論文
[1]聚酰亞胺分子動(dòng)力學(xué)模擬及涂膜干燥過(guò)程數(shù)值計(jì)算與優(yōu)化[D]. 李飛飛.華南理工大學(xué) 2017
[2]三氯生類似物對(duì)烯脂酰-ACP還原酶（FabI）的作用機(jī)制及其抑菌機(jī)理研究[D]. 楊旭云.天津理工大學(xué) 2016
[3]海參溶菌酶C端多肽異構(gòu)肽酶的性質(zhì)研究[D]. 牛慶昌.大連工業(yè)大學(xué) 2015
[4]FabI抑制劑的分子作用機(jī)制及藥物設(shè)計(jì)研究[D]. 艾義新.天津理工大學(xué) 2014
[5]溶菌酶抗菌肽的制備、分離與鑒定[D]. 朱伶俐.江南大學(xué) 2012
[6]海洋微生物溶菌酶的分離純化、保存及應(yīng)用研究[D]. 紀(jì)存朋.青島科技大學(xué) 2009
[7]海參腸中溶菌酶分離純化的工藝研究[D]. 李英輝.大連工業(yè)大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3518549