大黃魚是我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的海水魚,變形假單胞菌是養(yǎng)殖大黃魚內(nèi)臟白點病的病原。本實驗室前期分離到大黃魚內(nèi)臟白點病的病原菌變形假單胞菌NZBD9,通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)變形假單胞菌的secY和dksA基因在感染過程中顯著高表達。本文結(jié)合RNA干擾和dual RNA-seq技術(shù)探討secY和dksA基因在變形假單胞菌與大黃魚互作中的功能。首先針對secY和dksA基因的序列分別設(shè)計并合成5對shRNA用于沉默株構(gòu)建,然后用qRT-PCR方法挑選兩個基因的沉默效果最好的突變株以10⁴ cfu/g魚體重的劑量通過腹腔注射感染健康大黃魚來測定病原菌的毒力變化,最后取變形假單胞菌沉默株感染48 h后的大黃魚脾臟進行dual RNA-seq,并與野生株感染48 h的大黃魚脾臟的dual RNA-seq數(shù)據(jù)進行比較分析。主要結(jié)果如下:（1）本文設(shè)計合成的shRNA都能不同程度降低secY基因和dksA基因的表達量,其中secY基因沉默效果最佳的菌株為secY-shRNA-1165,其沉默效率為82.4%;dksA基因沉默效果最佳的菌株為dksA-shRNA-87,其沉默效率達96.... 

【文章來源】：集美大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 變形假單胞菌
        1.1.1 變形假單胞菌的生物學(xué)特性
        1.1.2 變形假單胞菌的致病性
        1.1.3 secY基因
        1.1.4 dksA基因
    1.2 魚類免疫學(xué)
        1.2.1 魚類免疫器官
        1.2.2 免疫細(xì)胞
        1.2.3 免疫因子
        1.2.4 細(xì)胞因子
    1.3 RNA干擾(RNAi)技術(shù)
        1.3.1 RNA干擾機制
        1.3.2 RNA干擾技術(shù)應(yīng)用
    1.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)
        1.4.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的研究進展
        1.4.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在水產(chǎn)動物免疫學(xué)上應(yīng)用
    1.5 病原與宿主相互作用研究
        1.5.1 病原與宿主相互作用的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進展
        1.5.2 病原與宿主相互作用的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究意義
    1.6 本研究的目的意義、內(nèi)容及創(chuàng)新點
        1.6.1 本研究的目的與意義
        1.6.2 研究內(nèi)容
        1.6.3 本研究的創(chuàng)新點
第2章 secY和 dksA基因?qū)ψ冃渭賳伟玖τ绊?br>    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 實驗菌株
        2.1.3 主要實驗試劑
        2.1.4 主要實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗證
        2.2.2 變形假單胞菌secY和 dksA基因沉默株構(gòu)建
        2.2.3 沉默效率測定篩選最佳沉默株
        2.2.4 變形假單胞菌生長曲線測定
        2.2.5 secY-RNAi strain和 dksA-RNAi strain毒力測定
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗證
        2.3.2 變形假單胞菌沉默菌株的沉默效率
        2.3.3 變形假單胞菌各菌株的體外培養(yǎng)生長速率
        2.3.4 變形假單胞菌各菌株對大黃魚的致病性
        2.3.5 感染變形假單胞菌后大黃魚脾臟癥狀
        2.3.6 變形假單胞菌沉默突變株在大黃魚主要組織器官中的相對載菌量
        2.3.7 變形假單胞菌secY基因和dksA基因感染過程中在大黃魚脾臟中的表達強度
    2.4 討論
第3章 大黃魚感染變形假單胞菌secY沉默株和dksA沉默株后脾臟dual RNA-seq
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 實驗菌株
    3.2 實驗方法
        3.2.1 菌株培養(yǎng)
        3.2.2 人工感染及樣品采集
        3.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序
        3.2.4 測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對
        3.2.5 樣本表達量計算
        3.2.6 差異基因表達分析
        3.2.7 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗證
        3.2.8 數(shù)據(jù)訪問
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量剪切后統(tǒng)計結(jié)果
        3.3.2 與變形假單胞菌參考基因組比對結(jié)果
        3.3.3 與大黃魚參考基因組比對結(jié)果
        3.3.4 secY沉默株感染大黃魚轉(zhuǎn)錄組分析
        3.3.5 dksA沉默株感染大黃魚轉(zhuǎn)錄組分析
        3.3.6 討論
第4章 結(jié)論與展望
    4.1 結(jié)論
    4.2 展望
致謝
參考文獻
在學(xué)期間科研成果情況


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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[6]基于RNA-Seq技術(shù)的人轉(zhuǎn)錄組分析研究[D]. 陳超.中南大學(xué) 2011
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本文編號：3491311