本文關鍵詞：髓系腫瘤中DNMT3A基因內甲基化態(tài)勢的臨床研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的檢測急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)、慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)和骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者及健康對照組標本中DNA甲基轉移酶3A基因(DNMT3A)基因內差異性甲基化區(qū)域2(DMR2)甲基化態(tài)勢,并統(tǒng)計分析其臨床意義。方法應用實時定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技術檢測56例AML患者及18例對照組中DNMT3A四種異構體的表達,應用定量甲基化特異性PCR(real-time quantitative methylation-specific PCR,RQ-MSP)技術檢測152例AML、82例CML、90例MDS及18例健康對照組中骨髓單個核細胞的DNMT3A DMR2甲基化狀態(tài),應用亞硫酸氫鹽測序(bisulfite sequencing PCR,PCR)技術分析DNMT3A DMR2區(qū)域的甲基化密度。結果AML、CML和MDS患者較對照組中均存在不同程度的DNMT3A DMR2低甲基化。(1)AML中DNMT3A DMR2甲基化152例AML患者中,84例(55%)為DNMT3A DMR2低甲基化。隨機挑選的兩例高甲基化患者BSP測序結果示甲基化密度為72.41%和93.97%,兩例低甲基化患者甲基化密度為1.72%和3.88%,DNMT3A DMR2高甲基化組的患者甲基化密度高于低甲基化組(隨機挑選的兩例對照組甲基化密度為60.34%和74.49%)。低甲基化與患者的年齡、性別、外周血白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)、FAB分型、WHO分型及染色體核型無關(P0.05)。DNMT3A DMR2低甲基化與DNMT3A基因、NPM1基因、FLT3基因、IDH1/2基因、C/EBPA基因、C/KIT基因、U2AF1基因以及RAS基因突變均無關(P0.05)。DNMT3A DMR2高甲基化組與低甲基化組患者經誘導治療后的完全緩解率(CR)相似(分別為52.5%和48.3%)。DNMT3A DMR2低甲基化患者的總體生存時間(OS)明顯短于高甲基化患者(兩組患者中位生存時間分別為7個月和11個月,P=0.034)。在非M3患者(兩組患者中位生存時間分別為7個月和9個月,P=0.019)和核型正�；颊�(兩組患者中位生存時間分別為7個月和25個月,P=0.011)中,低甲基化患者的總體生存時間同樣短于高甲基化患者。多因素分析顯示,在核型正常AML患者中,DNMT3A DMR2低甲基化是一個獨立的預后不良影響因素。DNMT3A四種異構體的表達均與DNMT3A DMR2的甲基化無相關性。(2)CML中DNMT3A DMR2甲基化82例CML患者中,60例(73%)為DNMT3A DMR2低甲基化,隨機挑選的兩例高甲基化患者BSP測序結果示甲基化密度為50.34%和37.16%,兩例低甲基化患者甲基化密度為2.07%和3.02%。低甲基化與患者的年齡、性別、外周血白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)以及核型分組無關(P0.05)。慢性期、加速期、急變期患者DNMT3A DMR2低甲基化頻率分別為72%(46/64)、100%(5/5)、69%(9/13),三組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)MDS中DNMT3A DMR2甲基化90例MDS患者中,64例(71%)為DNMT3A DMR2低甲基化,隨機挑選的兩例高甲基化患者BSP測序結果示甲基化密度為45.3%和51.7%,兩例低甲基化患者甲基化密度為0.49%和1.72%。低甲基化與患者的年齡、性別、外周血白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)無關(P0.05)。低甲基化與患者的WHO分型、核型危險分級以及國際預后評分系統(tǒng)(IPSS)分組無相關性(P0.05),DNMT3A DMR2低甲基化與DNMT3A基因、IDH1/2基因、U2AF1基因、SF3B1基因突變均無關(P0.05)。盡管DNMT3A DMR2低甲基化組的生存時間(中位生存時間為20個月)較DNMT3A DMR2高甲基化組(中位生存時間為33個月)為短,但該差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論(1)DNMT3A DMR2低甲基化是造血系統(tǒng)髓系腫瘤AML、CML和MDS患者中的一個常見分子事件;(2)在核型正常AML患者中,DNMT3A DMR2低甲基化是一個獨立的預后不良影響因素;(3)DNMT3A DMR2低甲基化與MDS患者預后無關。
【關鍵詞】：DNMT3A基因 甲基化 急性髓系白血病 慢性髓系白血病 骨髓增生異常綜合征 RQ-PCR RQ-MSP
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7;R551.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 英文縮略語14-16
• 第一章 引言16-23
• 1. DNMT3A基因與髓系腫瘤的研究進展16-23
• 1.1 DNA甲基化與髓系腫瘤16-17
• 1.2 DNA甲基轉移酶17-18
• 1.3 DNMT3A基因18-19
• 1.4 DNMT3A基因與髓系腫瘤19-23
• 1.4.1 AML19-20
• 1.4.2 CML20-22
• 1.4.3 MDS22-23
• 第二章 本論文研究的目的、方法及實驗方案的設計、意義23-26
• 2.1 研究目的23
• 2.2 研究方法及技術23-24
• 2.2.1 實時熒光定量PCR（RQ-PCR）23
• 2.2.2 實時定量甲基化特異性PCR（RQ-MSP）23-24
• 2.2.3 亞硫酸氫鹽測序24
• 2.3 實驗方案的設計24-25
• 2.4 本研究的意義25-26
• 第三章 AML患者中DNMT3A DMR2甲基化研究26-46
• 3.1 材料26-28
• 3.1.1 研究對象26
• 3.1.2 主要試劑26-27
• 3.1.3 主要儀器27
• 3.1.4 引物27-28
• 3.2 方法28-35
• 3.2.1 骨髓單個核細胞分離、RNA及基因組DNA提取28-29
• 3.2.2 DNA修飾（Epitect? Bisulfite Kit修飾DNA）29-30
• 3.2.3 逆轉錄30
• 3.2.4 DNMT3A四種異構體表達的RQ-PCR檢測30-31
• 3.2.5 DNMT3A DMR2的RQ-MSP檢測31-32
• 3.2.6 PCR產物純化回收32
• 3.2.7 重組載體構建32-33
• 3.2.8 重組質粒轉化33
• 3.2.9 重組質粒提取33-34
• 3.2.10 質粒鑒定、測序34
• 3.2.11 陽性模板建立34
• 3.2.12 細胞遺傳學檢查34
• 3.2.13 基因突變檢測34-35
• 3.2.14 統(tǒng)計學處理35
• 3.3 結果35-44
• 3.3.1 RQ-PCR方法靈敏度重復性特異性35-36
• 3.3.2 RQ-MSP靈敏度、重復性、特異性36-38
• 3.3.3 對照組及AML患者中DNMT3A DMR2甲基化水平38-40
• 3.3.4 AML中DNMT3A DMR2甲基化水平與臨床相關性40-41
• 3.3.5 DNMT3A DMR2甲基化態(tài)勢與AML患者預后分析41-43
• 3.3.6 AML患者中DNMT3A甲基化與表達相關性分析43-44
• 3.4 討論44-46
• 第四章 CML患者中DNMT3A DMR2甲基化研究46-52
• 4.1 材料46-47
• 4.1.1 研究對象46
• 4.1.2 主要試劑46
• 4.1.3 主要儀器46
• 4.1.4 引物46-47
• 4.2 方法47
• 4.2.1 骨髓單個核細胞分離、總RNA及基因組DNA制備47
• 4.2.2 DNA亞硫酸鹽修飾47
• 4.2.3 DNMT3A DMR2 RQ-MSP檢測47
• 4.2.4 PCR產物的純化回收47
• 4.2.5 重組載體構建47
• 4.2.6 重組質粒轉化47
• 4.2.7 重組質拉提取47
• 4.2.8 質粒鑒定、測序47
• 4.2.9 陽性模板建立47
• 4.2.10 細胞遺傳學檢查47
• 4.2.11 統(tǒng)計學處理47
• 4.3 結果47-50
• 4.3.1 對照組及CML患者DNMT3A DMR2甲基化水平47-49
• 4.3.2 DNMT3A DMR2甲基化與臨床相關性49-50
• 4.4 討論50-52
• 第五章 MDS患者中DNMT3A DMR2甲基化研究52-59
• 5.1 材料52-53
• 5.1.1 研究對象52-53
• 5.1.2 主要試劑53
• 5.1.3 主要儀器53
• 5.1.4 引物53
• 5.2 方法53-54
• 5.2.1 骨髓單個核細胞分離、總RNA及基因組DNA制備53
• 5.2.2 DNA亞硫酸鹽修飾53
• 5.2.3 DNMT3A DMR2 RQ-MSP檢測53
• 5.2.4 PCR產物的純化回收53
• 5.2.5 重組載體構建53
• 5.2.6 重組質粒轉化53
• 5.2.7 重組質拉提取53
• 5.2.8 質粒鑒定、測序53
• 5.2.9 陽性模板建立53
• 5.2.10 細胞遺傳學檢查53-54
• 5.2.11 基因突變檢測54
• 5.2.12 統(tǒng)計學處理54
• 5.3 結果54-57
• 5.3.1 對照組及MDS患者DNMT3A DMR2甲基化水平54-56
• 5.3.2 MDS患者中DNMT3A DMR2甲基化與臨床相關性56-57
• 5.3.3 DNMT3A DMR2甲基化態(tài)勢與MDS患者預后分析57
• 5.4 討論57-59
• 第六章 結論和展望59-60
• 6.1 主要結論59
• 6.2 展望59-60
• 參考文獻60-71
• 致謝71-73
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文及其他科研成果73

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1 章梁君;蔣能剛;周娟;葉遠馨;陸小軍;應斌武;江虹;;急性髓細胞白血病DNMT3A突變的免疫表型特征分析[J];臨床檢驗雜志;2014年08期

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2 吳艷鳳;DNMT1、DNMT3a異常表達與肺腺癌細胞對順鉑敏感性關系的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2014年

  本文關鍵詞：髓系腫瘤中DNMT3A基因內甲基化態(tài)勢的臨床研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：341264