發(fā)布時間：2017-04-27 13:09

  本文關鍵詞：灰葡萄孢致病缺陷突變體庫的建立及BcATM1基因的致病功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：灰霉病(gray mold)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的真菌病害,以雙子葉植物為主,可在200多種植物上發(fā)生,在果蔬保護地生產(chǎn)中,灰霉病已經(jīng)成為主要病害,據(jù)報道,世界上每年因該病導致的經(jīng)濟損失高達100-1000億美元。該病害的病原菌為灰葡萄孢(Botrytis cinerea),屬于子囊菌門(Ascomycota)真菌�；移咸焰呤堑湫偷乃荔w營養(yǎng)型病原真菌,研究表明,灰葡萄孢可產(chǎn)生多種致病因子參與致病過程,主要包括細胞壁降解酶類、角質酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反應的酶類、小RNA及小分子物質等。但是,對灰葡萄孢侵染植物的致病機制仍研究很少,對該領域進行深入研究,鑒定灰葡萄孢致病相關基因,不僅有助于揭示灰葡萄孢這種死體營養(yǎng)型病原真菌致病的分子機制,還有可能從中發(fā)現(xiàn)可以作為殺真菌劑作用靶標的蛋白因子,為開發(fā)防治灰霉病及其它類似病害的高效藥劑奠定理論和技術基礎。本論文采用正向遺傳學研究策略,在優(yōu)化轉化方法提高轉化效率至80-100/105個分生孢子基礎上,利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法(ATMT),構建了一個包含12000個轉化子的T-DNA隨機插入群體,并采用離體葉片接種法,對其進行致病力檢測,從中篩選出了463個致病力發(fā)生異常的突變體。通過southern blot檢測,該突變體庫中T-DNA隨機插入灰葡萄孢基因組的單拷貝率達到了53.8%,這為后續(xù)實驗中大規(guī)模鑒定灰葡萄孢致病相關基因提供了堅實的基礎。通過侵染不同的寄主植物,本論文還篩選到了23個突變體具有寄主侵染特異性�；趯ι鲜鐾蛔凅w庫的T-DNA插入位點分析,篩選到一株致病力缺陷突變體,其T-DNA插在ATM1同源基因終止密碼子下游169bp處,將該基因命名為Bc ATM1。Atm1是一類在真核生物中進化保守的線粒體內膜ABC轉運蛋白,在維持細胞正常生命過程中發(fā)揮重要的作用,但Atm1在病原菌致病過程的作用至今仍不清楚。本研究為了驗證其功能,通過反向遺傳學策略,采用同源替換的方法對該基因實施了定點敲除。表型分析發(fā)現(xiàn),突變體ΔBcatm1的分生孢子萌發(fā)緩慢且不同步,菌絲生長速度也顯著慢于野生型;離體葉片接種實驗顯示,突變體ΔBcatm1基本喪失了致病能力,在侵入寄主細胞后,只能在接種點附近引發(fā)微小的病斑,但不擴展。將完整的Bc ATM1基因重新導入突變體ΔBcatm1可以完全或部分恢復上述異常表型。表明Bc ATM1是一個關鍵的致病相關基因,參與了灰葡萄孢分生孢子的萌發(fā)、菌絲生長及侵染寄主等過程。
【關鍵詞】：灰葡萄孢 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化 突變體庫 ABC轉運蛋白 致病力
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S432.44
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文獻綜述12-18
• 1.1 植物灰霉病與灰葡萄孢12-15
• 1.1.1 植物灰霉病12-13
• 1.1.2 灰葡萄孢生物學分類13
• 1.1.3 灰葡萄孢的侵染循環(huán)13-14
• 1.1.4 灰葡萄孢的侵染途徑14-15
• 1.2 灰葡萄孢致病功能基因組學研究進展15-16
• 1.3 ABC-轉運蛋白的研究現(xiàn)狀16-17
• 1.4 目的和意義17-18
• 第二章 灰葡萄孢突變體庫的建立18-44
• 2.1 實驗材料18-22
• 2.1.1 供試菌株18
• 2.1.2 植物材料18
• 2.1.3 供試載體18
• 2.1.4 主要儀器和設備18-19
• 2.1.5 實驗藥品及試劑19
• 2.1.6 培養(yǎng)基19-21
• 2.1.7 引物21-22
• 2.2 實驗方法22-36
• 2.2.1 基因組DNA提取22-24
• 2.2.2 PCR反應24-26
• 2.2.3 酶切反應26
• 2.2.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉化26-27
• 2.2.5 雙元載體pBHt2轉化27
• 2.2.6 農(nóng)桿菌介導的灰葡萄孢T-DNA隨機插入轉化子群體的建立27-29
• 2.2.7 灰葡萄孢致病缺陷突變體庫的建立29-31
• 2.2.8 灰葡萄孢致病缺陷突變體庫的評價31-35
• 2.2.9 T-DNA插入位點的克隆35-36
• 2.3 結果與分析36-44
• 2.3.1 農(nóng)桿菌介導的灰葡萄孢T-DNA隨機插入轉化子群體的建立36-37
• 2.3.2 灰葡萄孢致病缺陷突變體庫的構建37-38
• 2.3.3 灰葡萄孢致病力缺陷突變體的寄主特異性檢測38-39
• 2.3.4 灰葡萄孢致病缺陷突變體庫的質量評價39-41
• 2.3.5 灰葡萄孢突變體T-DNA插入位點鑒定41-44
• 第三章 灰葡萄孢ABC轉運蛋白基因BcATM1的功能分析44-61
• 3.1 實驗材料44-46
• 3.1.1 供試菌株44
• 3.1.2 植物材料44
• 3.1.3 供試載體44
• 3.1.4 轉化子篩選培養(yǎng)基44-45
• 3.1.5 引物45-46
• 3.2 實驗方法46-54
• 3.2.1 質粒DNA提取46-47
• 3.2.2 連接反應47
• 3.2.3 重組反應47-48
• 3.2.4 大腸桿菌感受態(tài)的制備和轉化48-49
• 3.2.5 目的基因的序列分析49-50
• 3.2.6 基因缺失突變體的構建50-51
• 3.2.7 基因互補突變體的構建51-53
• 3.2.8 突變體鑒定53
• 3.2.9 目的基因的生物功能分析53-54
• 3.3 結果與分析54-61
• 3.3.1 致病相關基因BcATM1的鑒定及特征分析54-55
• 3.3.2 BcATM1基因的敲除載體的構建55-56
• 3.3.3 BcATM1基因的互補載體的構建56-57
• 3.3.4 BcATM1的突變體的分子鑒定57-58
• 3.3.5 BcATM1基因參與灰葡萄孢孢子萌發(fā)以及菌絲生長分析58-59
• 3.3.6 BcATM1基因參與灰葡萄孢侵染寄主植物分析59-61
• 第四章 結論61-63
• 展望63-64
• 參考文獻64-67
• 作者簡介67-68
• 致謝68-69

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  本文關鍵詞：灰葡萄孢致病缺陷突變體庫的建立及BcATM1基因的致病功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：330670