本文關(guān)鍵詞：NSun2基因敲除的小鼠胚胎干細胞系和小鼠模型的建立及基因功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胚胎干細胞(Embryonic stem cell, ESC)取自于著床前的囊胚內(nèi)細胞團,具有無限增殖的自我更新能力和分化為包括生殖系在內(nèi)的機體全部類型組織細胞的全能性。在一定的體外培養(yǎng)條件下,胚胎干細胞可以分化為心肌細胞、胰島p細胞、神經(jīng)細胞等多種類型的體細胞。胚胎干細胞全能性的特點,使其不僅為研究機體的發(fā)育機制和基因功能提供了良好的平臺,也在細胞替代治療等新興疾病治療手段中具有廣闊的應(yīng)用前景。哺乳動物在生物進化程度上更加接近于人類,是研究基因功能和疾病致病機理的良好模型。哺乳動物疾病模型,如嚙齒類的小鼠、大鼠疾病模型,豬的疾病模型和非人靈長類的猴子模型等,在對基因的功能和作用機制的探索、新藥研發(fā)及人類疾病的發(fā)病機理的研究和治療等方面發(fā)揮著非常重要的作用。要獲得遺傳修飾的哺乳動物疾病模型需要同時具備以下兩個因素：一方面是對遺傳物質(zhì)基因組DNA進行遺傳修飾,常見的技術(shù)包括物理、化學(xué)和病毒或者質(zhì)粒介導(dǎo)的隨機插入、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)介導(dǎo)的基因捕獲、同源重組和位點特異性核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因編輯等；二是將遺傳修飾拓展到個體水平并能夠通過生殖系傳遞到下一代,常見的技術(shù)包括胚胎原核注射、體細胞核移植、胚胎干細胞介導(dǎo)的生殖系嵌合以及單倍體胚胎干細胞替代精子與卵母細胞融合產(chǎn)生個體等。近幾年發(fā)展起來的位點特異性核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù),是一種定向改造基因組的遺傳修飾技術(shù),是進行基因組改造和探索基因功能的關(guān)鍵技術(shù)手段之一。目前常用的基因編輯技術(shù)主要包括ZFN (Zinc-finger nucleases)、TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)和CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9。其中CRISPR-Cas9技術(shù)由于構(gòu)建簡單、使用方便、周期短、基因編輯效率高而且價格便宜,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因修飾的干細胞系的建立和哺乳動物疾病模型的獲得。其主要原理是通過gRNA利用堿基互補配對靶向目的位點,引導(dǎo)Cas9在該位點進行切割從而產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(Double strand break, DSB),進而誘發(fā)內(nèi)源性的細胞修復(fù)機制,通過同源重組修復(fù)(Homologous directed repair, HDR)或非同源末端連接(Non-homologousend-joining NHEJ)將斷裂的雙鏈DNA連接起來,通過不同的修復(fù)方式以及利用設(shè)計好的帶有同源區(qū)段的供體質(zhì)�；蚬押塑账崞�,就可以實現(xiàn)基因敲除、外源基因或片段的定點插入、基因特定位點的定點突變以及染色體的大片段缺失和重排等遺傳修飾。根據(jù)文獻報道,NSun2基因是一種RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶,能夠在tRNA的胞嘧啶第5位的C原子上進行甲基化修飾(5mC),促進tRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)的生物合成,并能夠抑制Myc基因誘導(dǎo)的腫瘤增殖,對精子發(fā)生也具有非常重要的作用。另有報道稱NSun2基因異常會產(chǎn)生常染色體隱性的智力障礙。MRNA的甲基化修飾主要發(fā)生在腺苷酸第6位的N原子上(m6A),m6A修飾對mRNA的剪切,穩(wěn)定性,細胞內(nèi)的定位,翻譯等具有非常重要的作用。因而我們推測mRNA的m5C修飾也可能具有非常類似的功能,研究NSun2對mRNA的5mC甲基化修飾的作用將有助于我們弄清楚NSun2基因發(fā)揮功能的分子機制。為此我們利用CRISPR技術(shù)建立了NSun2基因純合敲除的胚胎干細胞(ESC)和小鼠動物模型,為后續(xù)的基因功能和分子機制的的探索、胚胎干細胞的重編程以及對小鼠的發(fā)育和代謝等研究提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：CRISPR 疾病模型 胚胎干細胞 NSun2 RNA甲基化
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 符號說明9-12
• 第一章 文獻綜述12-26
• 1.1 胚胎干細胞研究進展12-13
• 1.1.1 胚胎干細胞的獲得和應(yīng)用12
• 1.1.2 體細胞重編程為干細胞12-13
• 1.2 遺傳修飾技術(shù)在哺乳動物疾病模型建立中的研究進展13-22
• 1.2.1 傳統(tǒng)的遺傳修飾技術(shù)14-15
• 1.2.2 基因編輯技術(shù)15-22
• 1.3 RNA甲基化和NSun2基因功能研究進展22-25
• 1.3.1 m6A的研究進展22-24
• 1.3.2 NSun2基因功能研究進展24-25
• 1.4 本研究的目的和意義25-26
• 第二章 NSun2基因敲除小鼠胚胎干細胞系的建立和功能的初步研究26-46
• 2.1 材料和方法26-38
• 2.1.1 主要溶液配制26
• 2.1.2 主要儀器與設(shè)備26-27
• 2.1.3 主要試劑和耗材27-28
• 2.1.4 小鼠胚胎干細胞系的建立28-30
• 2.1.5 NSun2基因敲除打靶策略30
• 2.1.6 NSun2基因打靶質(zhì)粒的構(gòu)建和獲得30-33
• 2.1.7 篩選高效的sgRNA33
• 2.1.8 NSun2基因打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胚胎干細胞33-34
• 2.1.9 流式細胞儀分選34
• 2.1.10 挑取單克隆細胞系34
• 2.1.11 NSun2基因敲除胚胎干細胞基因型鑒定34-36
• 2.1.12 NSun2基因敲除的胚胎干細胞Western blot鑒定36-37
• 2.1.13 NSun2基因敲除的胚胎干細胞系表型分析37-38
• 2.2 結(jié)果及分析38-43
• 2.2.1 NSun2基因敲除的胚胎干細胞系的建立38-39
• 2.2.2 NSun2基因敲除的胚胎干細胞系基因型鑒定結(jié)果39-40
• 2.2.3 NSun2基因敲除的胚胎干細胞系Western Blot鑒定結(jié)果40-41
• 2.2.4 NSun2基因敲除的胚胎干細胞系表型分析結(jié)果41-43
• 2.3 討論43-45
• 2.4 結(jié)論45-46
• 第三章 建立NSun2基因敲除的小鼠模型46-58
• 3.1 材料與方法46-51
• 3.1.1 主要溶液配制46
• 3.1.2 主要儀器與設(shè)備46
• 3.1.3 主要試劑與耗材46
• 3.1.4 實驗動物46
• 3.1.5 NSun2基因敲除打靶策略46-47
• 3.1.6 NSun2基因打靶質(zhì)粒的構(gòu)建和獲得47
• 3.1.7 體外轉(zhuǎn)錄Cas9和sgRNA47-49
• 3.1.8 胚胎胞質(zhì)注射獲得F0代founder鼠49
• 3.1.9 F1代NSun2基因雜合敲除小鼠的獲得49-50
• 3.1.10 F2代NSun2基因純合敲除小鼠的獲得50-51
• 3.2 結(jié)果與分析51-56
• 3.2.1 獲得注射用的Cas9 RNA和sgRNA51
• 3.2.2 F0代founder鼠的獲得和基因型鑒定51-52
• 3.2.3 F1代NSun2基因敲除小鼠的獲得和基因型鑒定52
• 3.2.4 F2代NSun2基因敲除小鼠的獲得和基因型鑒定52-53
• 3.2.5 F2代NSun2基因敲除小鼠Western Blot鑒定53-54
• 3.2.6 NSun2基因敲除小鼠的表型54-56
• 3.3 討論56-57
• 3.4 結(jié)論57-58
• 參考文獻58-63
• 附錄63-71
• 致謝71-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文72

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本文編號：330481