本文關(guān)鍵詞：弓形蟲(chóng)ROP46基因缺失蟲(chóng)株構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：棒狀體蛋白(ROPs)是弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞的重要分泌蛋白,參與納蟲(chóng)空泡膜的形成、調(diào)控宿主細(xì)胞基因表達(dá)、調(diào)節(jié)蟲(chóng)株毒力以及宿主細(xì)胞與弓形蟲(chóng)之間相互作用。在弓形蟲(chóng)急性感染和慢性感染以及不同毒力弓形蟲(chóng)入侵細(xì)胞時(shí),ROP46蛋白表達(dá)量差異顯著。因此對(duì)ROP46蛋白的研究,可為弓形蟲(chóng)速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究提供參考,也為防治弓形蟲(chóng)病藥物的研制奠定基礎(chǔ)。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增ROP46基因,并克隆至原核蛋白表達(dá)載體,誘導(dǎo)ROP46蛋白表達(dá)。通過(guò)ELISA方法檢測(cè)ROP46與弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清的反應(yīng)。采用CRISPR/Cas9技術(shù),設(shè)計(jì)ROP46 gRNA,構(gòu)建ROP46基因敲除重組質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)藥物篩選、終點(diǎn)稀釋法和熒光顯微鏡篩選敲除蟲(chóng)株,純化ROP46基因缺失蟲(chóng)株。利用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法對(duì)ROP46基因缺失蟲(chóng)株的生長(zhǎng)特性進(jìn)行檢測(cè)和分析。將野生蟲(chóng)株和ROP46基因敲除蟲(chóng)株感染小白鼠,觀察兩種弓形蟲(chóng)的毒力差異。PCR擴(kuò)增的ROP46基因成功克隆至蛋白表達(dá)載體并表達(dá),ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,ROP46蛋白與弓形蟲(chóng)血清呈陽(yáng)性反應(yīng)。對(duì)ROP46基因敲除蟲(chóng)株進(jìn)行序列分析,測(cè)序結(jié)果顯示,ROP46基因的195到277位點(diǎn)均缺失了82個(gè)堿基,且該區(qū)域?yàn)镽OP46蛋白激酶功能區(qū),證明應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建的敲除重組質(zhì)粒成功的敲除了弓形蟲(chóng)PLK蟲(chóng)株的目的基因,并獲得了ROP46基因缺失蟲(chóng)株T.gondii/△ROP46。流式細(xì)胞術(shù)和計(jì)數(shù)法的結(jié)果顯示,ROP46基因缺失蟲(chóng)株的侵入和復(fù)制效率顯著降低。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,與感染NC對(duì)照蟲(chóng)株的小白鼠相比,感染ROP46基因敲除蟲(chóng)株的小白鼠的存活時(shí)間較長(zhǎng),證明ROP46對(duì)弓形蟲(chóng)的毒力有一定的影響。本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù),成功獲得可以穩(wěn)定遺傳的ROP46基因缺失蟲(chóng)株T.gondii/△ROP46,并證實(shí)ROP46顯著抑制弓形蟲(chóng)侵入復(fù)制能力及毒力。
【關(guān)鍵詞】：ROP46 CRISPR/Cas9 弓形蟲(chóng) 棒狀體
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 文獻(xiàn)綜述9-21
• 1.1 棒狀體9-17
• 1.1.1 概述9-10
• 1.1.2 棒狀體組成10-11
• 1.1.3 棒狀體蛋白的生物信息學(xué)11-12
• 1.1.4 棒狀體頸部蛋白和移動(dòng)復(fù)合體12-13
• 1.1.5 后基因組時(shí)代對(duì)棒狀體蛋白的分析13
• 1.1.6 弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白質(zhì)組的特征。13-14
• 1.1.7 已知重要的棒狀體蛋白14-17
• 1.2 CRISPR/Cas9技術(shù)17-19
• 1.2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)研究歷程17-18
• 1.2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與分類18
• 1.2.3 CRISPR/Cas9的作用機(jī)理18-19
• 1.3 研究目的與意義19-21
• 第二章 ROP46與弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清ELISA反應(yīng)21-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-22
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑21
• 2.1.3 主要設(shè)備儀器21
• 2.1.4 主要溶液及培養(yǎng)基的配制21-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-28
• 2.2.1 ROP46蛋白表達(dá)22-27
• 2.2.3 ROP46原核表達(dá)和純化27-28
• 2.2.4 ELISA檢測(cè)ROP46蛋白28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-31
• 2.3.1 弓形蟲(chóng)ROP46基因擴(kuò)增28-29
• 2.3.2 ROP46表達(dá)載體酶切鑒定29-30
• 2.3.3 ROP46在大腸桿菌中的表達(dá)30
• 2.3.4 ELISA檢測(cè)結(jié)果30-31
• 2.4 討論31-32
• 2.5 小結(jié)32-33
• 第三章 弓形蟲(chóng)Rop46基因的敲除及鑒定33-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料33
• 3.1.1 菌株和質(zhì)粒33
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法33-38
• 3.2.1 Rop46 敲除質(zhì)粒構(gòu)建33-35
• 3.2.2 轉(zhuǎn)染35
• 3.2.3 單克隆蟲(chóng)株篩選35-36
• 3.2.4 Rop46敲除蟲(chóng)株鑒定36-38
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-40
• 3.3.1 Rop46敲除質(zhì)粒pCD-Rop46的構(gòu)建38-39
• 3.3.2 Rop46敲除蟲(chóng)株的制備39
• 3.3.3 Rop46敲除蟲(chóng)株的初步鑒定39-40
• 3.3.4 Rop46基因缺失蟲(chóng)株的鑒定40
• 3.4 討論40-41
• 3.5 小結(jié)41-43
• 第四章 Rop46基因敲除蟲(chóng)株對(duì)PLK侵入和復(fù)制的影響43-49
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料43
• 4.1.1 菌株和細(xì)胞43
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法43-44
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-46
• 4.3.1 侵入復(fù)制44-45
• 4.3.2 毒力測(cè)定45-46
• 4.4 討論46-47
• 4.5 小結(jié)47-49
• 第五章 結(jié)論49-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 致謝57-59
• 個(gè)人簡(jiǎn)介59

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本文編號(hào)：331673