本文關(guān)鍵詞：張應(yīng)力對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖分化的影響及基因譜差異分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:正畸治療和牽張成骨的生物學(xué)基礎(chǔ)是顱頜面部骨組織對(duì)應(yīng)力刺激的適應(yīng)性改建作用,在骨改建的過程中,成骨細(xì)胞起著重要的作用,成骨細(xì)胞是骨組織中的主要細(xì)胞,也是體內(nèi)的應(yīng)力敏感型細(xì)胞,在骨代謝過程中具有中心調(diào)控作用。適宜強(qiáng)度和作用時(shí)間的應(yīng)力刺激可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖活性,誘導(dǎo)新骨形成,但細(xì)胞是如何感知外界力學(xué)刺激信號(hào)并將其轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)生物學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不明確。以往學(xué)者們只對(duì)一個(gè)或幾個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行研究,很難全面的了解成骨細(xì)胞對(duì)力學(xué)信號(hào)應(yīng)答的分子機(jī)制。故本實(shí)驗(yàn)使用Flexcell 5000細(xì)胞拉伸加載裝置對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1加載周期性牽張應(yīng)力,用MTT法檢測張應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化的影響,并篩選出促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的最適力值,采用Affymetrix基因表達(dá)譜芯片技術(shù),檢測最適應(yīng)力刺激成骨細(xì)胞后全基因組差異基因的表達(dá)情況,通過基因差異分析,從分子水平探討成骨細(xì)胞對(duì)力學(xué)信號(hào)的應(yīng)答機(jī)制,為臨床上正畸治療和牽張成骨提供分子理論基礎(chǔ)。方法:1成骨細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)將凍存的原代小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇,鏡下觀察細(xì)胞生長情況,待細(xì)胞長滿瓶底80%,且生長狀況良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。2成骨細(xì)胞的接種取生長狀態(tài)良好的第5代成骨細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,以2×105/孔的細(xì)胞濃度接種于5個(gè)Bioflex彈性基底膜六孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)液更換為低濃度血清培養(yǎng)液,使之同步化生長24 h后待用。3建立成骨細(xì)胞體外加力模型將5個(gè)6孔培養(yǎng)板隨機(jī)分為A、B、C、D、E五組,每組6孔,每孔換成2 ml 10%血清培養(yǎng)液,使用Flexercell 5000應(yīng)力加載儀進(jìn)行加力,每組分別施加0%、6%、12%、18%、22%的拉伸力,頻率0.1 Hz,即6周/min(5 S牽拉,5 S松弛),波形為1/2正弦,加力時(shí)間為24 h。4成骨細(xì)胞增殖活性的檢測加力結(jié)束后,使用mtt法檢測各組細(xì)胞的增殖情況,用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各組細(xì)胞在490nm處的吸光度值(opticaldensity,od),記錄數(shù)據(jù),并使用spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。5細(xì)胞總rna的提取收集最適應(yīng)力組和對(duì)照組的細(xì)胞,使用trizol法提取細(xì)胞的總rna,并測定rna的純度和完整性。6基因芯片檢測應(yīng)用affymetrix全基因組表達(dá)譜芯片檢測最適應(yīng)力組和對(duì)照組的基因表達(dá)水平并掃描分析。采用transcriptomeanalysisconsole3.0分析軟件對(duì)掃描結(jié)果進(jìn)行分析,篩選差異基因。結(jié)果:1mtt結(jié)果:成骨細(xì)胞加載周期性張應(yīng)力24h后各組吸光度值的比較:(1)0%對(duì)照組(a組):0.3931±0.0538(2)6%形變率(b組):0.4621±0.0120;(3)12%形變率(c組):0.5423±0.0148;(4)18%形變率(d組):0.4511±0.0369;(5)22%形變率(e組):0.3623±0.0324。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間成骨細(xì)胞吸光度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01)。6%、12%、18%實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力較0%對(duì)照組(a組)增強(qiáng),但以12%形變率的c組細(xì)胞增殖最為顯著(p0.01),22%形變率的e組od值小于0%對(duì)照組(a組),抑制細(xì)胞的增殖(p0.01)。因此,我們認(rèn)為c組12%形變率為促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的最適力值(如圖4,表1)。2總rna純度及完整性鑒定1)紫外分光光度計(jì)檢測顯示:a、c兩組細(xì)胞總rna的od260/od280比值均在1.9~2.1之間,純度及濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。2)凝膠電泳結(jié)果顯示:a、c兩組樣本提取的mrna經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可見三個(gè)條帶出現(xiàn),且第一條帶(28s)亮度約為第二條(18s)的兩倍,最下面一條(5s)最淡,說明a、c兩組樣本提取的rna完整性較好。3基因表達(dá)譜結(jié)果:12%形變率的周期性張應(yīng)力(c組)加載成骨細(xì)胞24h后,與對(duì)照組(a組)相比,2倍以上變化的差異表達(dá)基因有722個(gè),其中560個(gè)表達(dá)上調(diào),162個(gè)表達(dá)下調(diào),與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的差異基因主要有rho、sost、wnt3a、bmp4、mapk10、mapk3,分別為對(duì)照組的2.35、-2.37、2.15、3.19、2.71、2.53倍,其所在的bmp/smads信號(hào)通路、wnt信號(hào)通路和mapk信號(hào)通路參與了力學(xué)誘導(dǎo)下細(xì)胞增殖分化的過程。結(jié)論:1適當(dāng)?shù)膹垜?yīng)力在一定加力時(shí)間條件下,可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖活性,力值過大會(huì)抑制細(xì)胞的增殖。2適當(dāng)?shù)膹垜?yīng)力加載成骨細(xì)胞后,基因的表達(dá)發(fā)生改變,細(xì)胞增殖分化相關(guān)的差異基因Rho、Wnt3a、BMP4、MAPK10和MAPK3的表達(dá)上調(diào),SOST的表達(dá)下調(diào)。3 SOST、Wnt3a、BMP4、Rho、MAPK10和MAPK3基因可通過與成骨相關(guān)的Wnt、BMP/smads、MAPK三條信號(hào)通路來調(diào)控力學(xué)刺激誘導(dǎo)下成骨細(xì)胞的增殖分化過程。
【關(guān)鍵詞】：周期性張應(yīng)力 成骨細(xì)胞 增殖 基因芯片 MTT法
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R783.5
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-24
• 結(jié)果24-25
• 附圖25-32
• 附表32-41
• 討論41-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 綜述 應(yīng)力刺激對(duì)成骨細(xì)胞作用的相關(guān)研究53-66
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 致謝66-67
• 個(gè)人簡歷67

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