本文關(guān)鍵詞：張應力對小鼠成骨細胞增殖分化的影響及基因譜差異分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:正畸治療和牽張成骨的生物學基礎是顱頜面部骨組織對應力刺激的適應性改建作用,在骨改建的過程中,成骨細胞起著重要的作用,成骨細胞是骨組織中的主要細胞,也是體內(nèi)的應力敏感型細胞,在骨代謝過程中具有中心調(diào)控作用。適宜強度和作用時間的應力刺激可有效促進成骨細胞的增殖活性,誘導新骨形成,但細胞是如何感知外界力學刺激信號并將其轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)生物學信號的轉(zhuǎn)導機制尚不明確。以往學者們只對一個或幾個相關(guān)基因進行研究,很難全面的了解成骨細胞對力學信號應答的分子機制。故本實驗使用Flexcell 5000細胞拉伸加載裝置對體外培養(yǎng)的小鼠成骨細胞MC3T3-E1加載周期性牽張應力,用MTT法檢測張應力對成骨細胞增殖分化的影響,并篩選出促進成骨細胞增殖的最適力值,采用Affymetrix基因表達譜芯片技術(shù),檢測最適應力刺激成骨細胞后全基因組差異基因的表達情況,通過基因差異分析,從分子水平探討成骨細胞對力學信號的應答機制,為臨床上正畸治療和牽張成骨提供分子理論基礎。方法:1成骨細胞的復蘇和傳代培養(yǎng)將凍存的原代小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1進行細胞復蘇,鏡下觀察細胞生長情況,待細胞長滿瓶底80%,且生長狀況良好時進行細胞傳代。2成骨細胞的接種取生長狀態(tài)良好的第5代成骨細胞,制備成單細胞懸液,以2×105/孔的細胞濃度接種于5個Bioflex彈性基底膜六孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)液更換為低濃度血清培養(yǎng)液,使之同步化生長24 h后待用。3建立成骨細胞體外加力模型將5個6孔培養(yǎng)板隨機分為A、B、C、D、E五組,每組6孔,每孔換成2 ml 10%血清培養(yǎng)液,使用Flexercell 5000應力加載儀進行加力,每組分別施加0%、6%、12%、18%、22%的拉伸力,頻率0.1 Hz,即6周/min(5 S牽拉,5 S松弛),波形為1/2正弦,加力時間為24 h。4成骨細胞增殖活性的檢測加力結(jié)束后,使用mtt法檢測各組細胞的增殖情況,用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各組細胞在490nm處的吸光度值(opticaldensity,od),記錄數(shù)據(jù),并使用spss19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。5細胞總rna的提取收集最適應力組和對照組的細胞,使用trizol法提取細胞的總rna,并測定rna的純度和完整性。6基因芯片檢測應用affymetrix全基因組表達譜芯片檢測最適應力組和對照組的基因表達水平并掃描分析。采用transcriptomeanalysisconsole3.0分析軟件對掃描結(jié)果進行分析,篩選差異基因。結(jié)果:1mtt結(jié)果:成骨細胞加載周期性張應力24h后各組吸光度值的比較:(1)0%對照組(a組):0.3931±0.0538(2)6%形變率(b組):0.4621±0.0120;(3)12%形變率(c組):0.5423±0.0148;(4)18%形變率(d組):0.4511±0.0369;(5)22%形變率(e組):0.3623±0.0324。各實驗組與對照組之間成骨細胞吸光度值有統(tǒng)計學差異(p0.01)。6%、12%、18%實驗組細胞增殖能力較0%對照組(a組)增強,但以12%形變率的c組細胞增殖最為顯著(p0.01),22%形變率的e組od值小于0%對照組(a組),抑制細胞的增殖(p0.01)。因此,我們認為c組12%形變率為促進成骨細胞增殖的最適力值(如圖4,表1)。2總rna純度及完整性鑒定1)紫外分光光度計檢測顯示:a、c兩組細胞總rna的od260/od280比值均在1.9~2.1之間,純度及濃度符合實驗要求。2)凝膠電泳結(jié)果顯示:a、c兩組樣本提取的mrna經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可見三個條帶出現(xiàn),且第一條帶(28s)亮度約為第二條(18s)的兩倍,最下面一條(5s)最淡,說明a、c兩組樣本提取的rna完整性較好。3基因表達譜結(jié)果:12%形變率的周期性張應力(c組)加載成骨細胞24h后,與對照組(a組)相比,2倍以上變化的差異表達基因有722個,其中560個表達上調(diào),162個表達下調(diào),與細胞增殖分化相關(guān)的差異基因主要有rho、sost、wnt3a、bmp4、mapk10、mapk3,分別為對照組的2.35、-2.37、2.15、3.19、2.71、2.53倍,其所在的bmp/smads信號通路、wnt信號通路和mapk信號通路參與了力學誘導下細胞增殖分化的過程。結(jié)論:1適當?shù)膹垜υ谝欢恿r間條件下,可促進成骨細胞的增殖活性,力值過大會抑制細胞的增殖。2適當?shù)膹垜虞d成骨細胞后,基因的表達發(fā)生改變,細胞增殖分化相關(guān)的差異基因Rho、Wnt3a、BMP4、MAPK10和MAPK3的表達上調(diào),SOST的表達下調(diào)。3 SOST、Wnt3a、BMP4、Rho、MAPK10和MAPK3基因可通過與成骨相關(guān)的Wnt、BMP/smads、MAPK三條信號通路來調(diào)控力學刺激誘導下成骨細胞的增殖分化過程。
【關(guān)鍵詞】：周期性張應力 成骨細胞 增殖 基因芯片 MTT法
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R783.5
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-24
• 結(jié)果24-25
• 附圖25-32
• 附表32-41
• 討論41-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻47-53
• 綜述 應力刺激對成骨細胞作用的相關(guān)研究53-66
• 參考文獻60-66
• 致謝66-67
• 個人簡歷67

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