發(fā)布時(shí)間：2017-04-26 07:18

  本文關(guān)鍵詞：大葉落地生根KdSOC1基因的克隆與功能的初步鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大葉落地生根(Kalanchoe daigremontiana),為景天科伽藍(lán)菜屬多年生草本植物,葉緣所形成的胎生苗是無(wú)性繁殖的方式,是典型的植物體細(xì)胞全能性的體現(xiàn),即葉緣體細(xì)胞直接通過(guò)分化形成新個(gè)體。然而針對(duì)這種極為特殊的無(wú)性繁殖方式,迄今沒(méi)有研究闡明胎生苗形成過(guò)程所涉及的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在實(shí)驗(yàn)室前人構(gòu)建的落地生根cDNA文庫(kù)中,發(fā)現(xiàn)一個(gè)與擬南芥SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1(SOC1)基因同源的EST序列(contig1019)。本研究通過(guò)RACE和Genome Walking技術(shù)克隆了KdSOC1基因cDNA全長(zhǎng)和啟動(dòng)子,進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析,探究了該基因的表達(dá)模式并構(gòu)建了大葉落地生根遺傳轉(zhuǎn)化體系及愈傷組織誘導(dǎo)體系,為后期深入研究KdSOC1基因功能奠定了基礎(chǔ)。主要結(jié)論如下：1通過(guò)RACE技術(shù)獲得KdSOC1基因cDNA全長(zhǎng)為1410bp,BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)與山核桃SOC1基因同源性相似度達(dá)70%,故而命名為KdSOC1基因。其ORF全長(zhǎng)為684bp,編碼227個(gè)氨基酸,CDS具有保守區(qū)域MADS-MEF2-like和K-bcx,屬于植物MADS Ⅱ型基因。2通過(guò)Genome Walking技術(shù)獲得KdSOC1啟動(dòng)子序列為1401bp,進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因具有ABRE (ABA作用元件)、CGTCA-motif (MeJA作用元件)、GARE-motif(GA作用元件)、TCA-element (SA作用元件)、rbcS-CMA7a(光響應(yīng)作用元件)、TATA-box (核心轉(zhuǎn)錄起始單元)、CAA-box(轉(zhuǎn)錄起始單元)。說(shuō)明該基因受到多種激素信號(hào)的調(diào)節(jié),同時(shí)參與多個(gè)代謝反應(yīng)。3在啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)基礎(chǔ)上,結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR和半定量RT-PCR技術(shù)分析了該基因在激素(ABA、SA、GA、MeJA)誘導(dǎo)下及不同環(huán)境(自然干旱和長(zhǎng)短日照)下的表達(dá)模式。激素誘導(dǎo)結(jié)果表明,KdSOC1基因?qū)BA、GA、MeJA和SA激素均有響應(yīng),而對(duì)SA和GA響應(yīng)顯著且持久。不同光周期誘導(dǎo)結(jié)果顯示,LD誘導(dǎo)下,植物葉片中KdSOC1基因的表達(dá)水平高于SD誘導(dǎo)下的表達(dá)量；LD誘導(dǎo)下,KdSOC1基因的表達(dá)量急速增加,培養(yǎng)37天時(shí)該基因的表達(dá)量相對(duì)于28天時(shí)增加了約10倍,同時(shí)伴隨胎生苗的快速產(chǎn)生。自然干旱結(jié)果顯示,隨著干旱程度的加深,KdSOC1基因的表達(dá)量逐漸增多,輕度干旱時(shí)基因的表達(dá)水平高于CK1,而中度、重度干旱時(shí)基因的表達(dá)水平低于CK2-3,此現(xiàn)象與植株產(chǎn)生胎生苗的情況一致。因此,KdSOC1基因能感知和傳遞環(huán)境刺激信號(hào)并參與胎生苗的形成。4本研究構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體pBIN438-ORF KdSOCI、RNA干擾載體pZH01-AS ORF KdSOC1-GUS-S ORFKdSOC1及啟動(dòng)子載體pBI121-PromoterKedSOC1-GUS載體,并以pBI438載體(NPTⅡ作為篩選標(biāo)記基因)初步成功構(gòu)建了落地生根轉(zhuǎn)化體系,為深入研究該基因的功能及其對(duì)胎生苗形成的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。5為創(chuàng)建胎生苗“體細(xì)胞”體外快速研究體系,本研究初步建立高效、高質(zhì)量落地生根愈傷組織誘導(dǎo)體系,以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度6-BA與2,4-D對(duì)主莖段、幼嫩及成熟葉片三種外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。研究結(jié)果表明,主莖段最佳愈傷誘導(dǎo)激素濃度比例為0.5mg/L 6-BA:0.5mg/L 2,4-D,胚性愈傷發(fā)生率為55.56%；幼嫩葉片最佳愈傷誘導(dǎo)激素濃度比例為lmg/L 6-BA:1.5mg/L 2,4-D,胚性愈傷發(fā)生率為29.92%；成熟葉片最佳愈傷誘導(dǎo)激素濃度比例為2.5mg/L6-BA:0.5mg/L 2,4-D,胚性愈傷發(fā)生率為43.07%。因此主莖段與成熟葉片均為誘導(dǎo)大葉落地生根愈傷組織形成的理想材料。
【關(guān)鍵詞】：大葉落地生根 胎生苗的形成 KdSOC1 表達(dá)分析 遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略詞7-13
• 1 引言13-21
• 1.1 大葉落地生根胎生苗形成研究概況13-16
• 1.1.1 胎生苗的形成發(fā)育過(guò)程13-14
• 1.1.2 胎生苗的形成發(fā)育過(guò)程中相關(guān)基因與功能研究14-15
• 1.1.3 無(wú)性繁殖演變15-16
• 1.2 大葉落地生根遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展16
• 1.3 SOC1基因的研究進(jìn)展16-19
• 1.3.1 SOC1基因的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)特征17
• 1.3.2 SOC1基因的表達(dá)調(diào)控17-18
• 1.3.3 SOC1基因的功能18-19
• 1.4 本研究目的內(nèi)容及技術(shù)路線19-21
• 1.4.1 研究背景19
• 1.4.2 研究目的19
• 1.4.3 研究?jī)?nèi)容19-20
• 1.4.4 技術(shù)路線20-21
• 2 大葉落地生根KdSOC1基因cDNA的獲得及生物信息分析21-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21
• 2.1.1 植物材料21
• 2.1.2 主要酶與試劑21
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備21
• 2.1.4 常用培養(yǎng)基21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-27
• 2.2.1 大葉落地生根葉片總RNA的提取21
• 2.2.2 大葉落地生根cDNA的合成21-22
• 2.2.3 KdSOC1基因全長(zhǎng)的獲得22-26
• 2.2.4 KdSOC1基因序列的生物學(xué)分析26-27
• 2.2.5 多重序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析27
• 2.3 結(jié)果與分析27-32
• 2.3.1 KdSOC1基因的克隆與序列分析27-28
• 2.3.2 KdSOC1蛋白序列分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)28-30
• 2.3.3 同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析30-32
• 2.4 討論32-33
• 3 大葉落地生根KdSOC1基因啟動(dòng)子的克隆與分析33-40
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料33
• 3.1.1 植物材料33
• 3.1.2 主要酶與試劑33
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備33
• 3.1.4 常用培養(yǎng)基33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法33-36
• 3.2.1 大葉落地生根DNA的提取33
• 3.2.2 KdSOC1基因啟動(dòng)子的克隆33-36
• 3.2.3 生物信息學(xué)分析36
• 3.3 結(jié)果與分析36-39
• 3.3.1 大葉落地生根KdSOC1基因啟動(dòng)子的克隆37
• 3.3.2 大葉落地生根KdSOC1基因啟動(dòng)子序列分析37-39
• 3.4 討論39-40
• 4 大葉落地生根KdSOC1基因的表達(dá)分析40-48
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理40-41
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料40
• 4.1.2 材料處理40-41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法41-42
• 4.2.1 不同處理下落地生根總RNA的提取及cDNA的合成41
• 4.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR41-42
• 4.2.3 半定量RT-PCR42
• 4.3 結(jié)果與分析42-45
• 4.3.1 KdSOC1基因在不同激素誘導(dǎo)下的表達(dá)分析42-43
• 4.3.2 KdSOC1基因在不同光周期下的表達(dá)分析43-44
• 4.3.3 干旱脅迫下KdSOC1基因的表達(dá)分析44-45
• 4.4 討論45-48
• 4.4.1 不同激素誘導(dǎo)下KdSOC1基因的表達(dá)分析45-46
• 4.4.2 不同光周期下KdSOC1基因的表達(dá)分析46
• 4.4.3 自然干旱處理下KdSOC1基因的表達(dá)分析46-48
• 5 大葉落地生根遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建48-61
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料48
• 5.1.1 植物材料48
• 5.1.2 載體與菌株48
• 5.1.3 主要酶與試劑48
• 5.1.4 主要儀器設(shè)備48
• 5.1.5 主要培養(yǎng)基48
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法48-53
• 5.2.1 RNA的提取及cDNA的合成48-49
• 5.2.2 引物設(shè)計(jì)49
• 5.2.3 過(guò)表達(dá)載體pBIN438-ORF_(KdSOC1)的構(gòu)建49-51
• 5.2.4 干擾載體pZH01-AS ORF_(KdSOC1)-GUS-S ORF _(KdSOC1)的構(gòu)建51-52
• 5.2.5 啟動(dòng)子載體pBI121-Promoter_(KdSOC1)-GUS的構(gòu)建52
• 5.2.6 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及鑒定52
• 5.2.7 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大葉落地生根52-53
• 5.2.8 主要儀器設(shè)備53
• 5.2.9 主要培養(yǎng)基53
• 5.3 結(jié)果與分析53-59
• 5.3.1 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建53-54
• 5.3.2 干擾載體的構(gòu)建54
• 5.3.3 啟動(dòng)子載體的構(gòu)建54-55
• 5.3.4 落地生根不同外植體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率55-56
• 5.3.5 參考Truesdale MR等建立的落地生根轉(zhuǎn)化體系56-57
• 5.3.6 類似于擬南芥花粉轉(zhuǎn)化法57
• 5.3.7 參考Garces等人建立的落地生根轉(zhuǎn)化體系57-59
• 5.4 討論59-61
• 5.4.1 落地生根轉(zhuǎn)化效率59
• 5.4.2 落地生根遺傳轉(zhuǎn)化體系59-61
• 6 大葉落地生根愈傷組織誘導(dǎo)體系的優(yōu)化61-73
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料61
• 6.1.1 植物材料61
• 6.1.2 菌株與質(zhì)粒61
• 6.1.3 主要試劑61
• 6.1.4 主要儀器設(shè)備61
• 6.2 方法61-62
• 6.2.1 外植體處理61
• 6.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件61-62
• 6.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)62
• 6.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析62
• 6.2.5 落地生根愈傷組織的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化62
• 6.3 結(jié)果與分析62-71
• 6.3.1 不同外植體愈傷誘導(dǎo)效率62-64
• 6.3.2 植物激素配比對(duì)不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響64-69
• 6.3.3 不同外植體最佳愈傷誘導(dǎo)激素比例69-70
• 6.3.4 侵染時(shí)間對(duì)落地生根愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的影響70-71
• 6.4 討論71-73
• 6.4.1 大葉落地生根愈傷組織誘導(dǎo)71
• 6.4.2 大葉落地生根愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化71-73
• 7 總結(jié)與展望73-75
• 7.1 總結(jié)73
• 7.2 展望73-75
• 參考文獻(xiàn)75-81
• 個(gè)人簡(jiǎn)介81-82
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介82-83
• 致謝83

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 劉建華;大葉落地生根是營(yíng)養(yǎng)繁殖的好材料[J];生物學(xué)通報(bào);2002年10期

2 游義霞;黃先忠;鄭銀英;崔百明;;大葉落地生根STM基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及煙草轉(zhuǎn)化[J];石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年03期

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本文編號(hào)：328005